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文献解读

集思慧远客户发表《绿色草莓个体重测序揭示全基因组范围内变异及自交不亲和候选基因分析》

发布日期:2019-03-17 浏览次数:399

  摘要

  草莓属配子体不亲和系统的研究已经广为人知了,但是其遗传机制目前仍是未知的。通过人工自花授粉获得了11个不同亲和性的第二世代绿色草莓,用来代表不同的坐果率水平。本研究对两个较大差异坐果率的自交系进行全基因组重测序,Ls-S2-53(自交不亲和)和Ls-S2-76(强自交亲和)。利用完全自交亲和的野草莓作为参考样品,进行两个绿色草莓全基因组变异检测和注释分析。两测序样品间每条染色体上的多态分布都很相似,但是纯合变异的数量和分布区域是不一致的。基因表达分析表明6个和自交不亲和显著相关的候选基因,用野草莓基因组作为参考,将一个FIP2-like(肌动蛋白骨架合成相关)作为两个自交不亲和自交系的候选基因,该基因编码的肽链在两个材料中均存在不同长短的数量的氨基酸数量的丢失。通过抑制FIP2-like的表达减少了花粉管顶端F-actin的合成,在一定程度上抑制了花粉粒的生成和花粉管的发育。研究结果表明差异的纯合变异分布影响了绿色草莓的果实坐果率,完整编码的FIP2-like能够正常促进F-actin的合成,而较短氨基酸序列的FIP2-like对两个自花授粉草莓的亲和性有影响。


  材料方法

  植物材料:F.viridis 42,Ls-S1-2,11个Ls-S1-2自交系;测序材料:Ls-S2-53,Ls-S2-76(幼嫩叶片);Ls-S2-53人工自花授粉后(0h)叶、花梗、花萼、花瓣、雌蕊、花药用来做组织特异表达分析,雌蕊自花授粉后(6,12,24,48,72h)做时空表达分析。

  测序策略:Illumina Hiseq 2500,Ls-S2-53(80X),Ls-S2-76(75X)。

  参考基因组:F. vesca reference genome v2.0.a1;

  比对参考基因组:BWA v0.6.1,过滤冗余序列:SAMtools,变异检测:GATK

  变异位点注释:SnpEff,基因功能注释:NR,Swiss-Prot,GO,COG,KEGG。

  配子体自交不亲和候选基因挑选:研究报道,除了S-locus基因外,一些发生修饰改变的基因也参与花粉管发育(生理生化代谢,信号转导,),挑选的候选基因基于基因功能注释及序列突变分析(非同义突变,终止密码子获得或丢失,移码突变,编码缺失等),共挑选17个基因进行组织特异表达分析。

  F-actin体外可视化:Zeiss LSM 800 confocal laser scanning microscope;

  FIP2-like亚细胞定位:完全可育材料F.vesca 41花药cDNA全长,载体pDONR221,特异引物:FIP2-like-Sub。农杆菌介导,本氏烟叶片


  研究结果

  1、果实性状及花粉管特征



  F.vesca 41坐果率100%,绿色草莓品种,F1,其他11个F2坐果率(2%-80%),花柱中花粉管穿过的比例(人工授粉后12h出现)。


  2、基因组重测序及比对分析

  Ls-S2-53,Ls-S2-76测序数据分别clean base 19G,17.6G,覆盖90%基因组



  全基因组范围内两个亲和性不同的株系变异信息(内-外:SV,INDEL,SNP)

  纯合突变区域在全基因组的分布情况(SNP,indel区间杂合度<10%),横坐标代表每条染色体物理位置,纵坐标(左)标记数量,(右)染色体;纯合区域:红框。


  3、变异位点功能注释

  基因间区变异信息远超过CDS区,CDS区内部内含子突变高于外显子。SNP分布比例由高到低:基因间区,外显子,CDS,内含子;INDEL分布比例由高到低:基因间区,内含子,CDS,外显子。


  部分Pfam数据库注释到的非同义(橙色),同义突变基因(粉色)。


  根据功能注释和基因发生的变异信息挑选的146个可能与自交不亲和相关的基因在基因组上的分布。


  4、随机挑选候选基因RT-PCR验证

  自交不亲和品系17个基因的人工自花授粉后(0,12,24,48,72h)雌蕊中的时空表达分析(左),叶、花梗、花萼、花瓣、雌蕊、花药组织特异性表达分析(右);大多数基因主要是在雌蕊或花药中高表达,进而对候选基因FIP2-like,在强自交亲和性材料和完全自交亲和材料中进行表达模式分析,发现自交亲和与强自交亲和材料表现相似,但与完全亲和材料不同。FIP2-like在花药中随着花药的成熟,表达量也是逐渐上升的,并且在花粉中的表达量也高于花药。


  5、自交不亲和候选基因FIP2-like克隆

  a.P1:完全自交亲和,P2:自交不亲和,P3:强自交亲和;b.1/2分别以DNA和cDNA为模板扩增完全亲和全长FIP2-like,3/4不亲和材料(该基因无内含子);c.结构域分析(P2,P3功能结构域截断或缺失)


  6、FIP2-like瞬时表达

  a/c. Ls-S2-53, Ls-S2-76, F. vesca以及增加或抑制F-actin材料之间花粉粒发芽速率比较表明,随着F-actin含量的上升,发芽速率逐渐上升,含量出现下降,发芽速率也随之下降。b.花粉管绿色荧光表示F-actin含量,完全自交亲和材料增加或者抑制F-actin,荧光强弱符合一致性。亚细胞定位结果表明:FIP2-like存在细胞膜和细胞核中。


  研究亮点

  针对两个自交不亲和草莓品系的重测序数据分析,利用生信分析的手段鉴定到一系列与自交不亲和性相关的候选基因。

  1、挑选了17个候选基因进行组织特异性表达和时空特异表达检测分析,大多数基因是在雌蕊或花药中高表达,而针对其中感兴趣的FIP2-like在花药中的时空表达分析表明该基因随着花药的成熟,表达量逐渐上调。

  2、针对其中FIP2-like进行不同亲和性材料中的克隆比较,发现自交不亲和材料与完全亲和材料间该基因编码蛋白长度缺失了一段。

  3、亚细胞定位表明FIP2-like存在细胞膜和细胞核中,瞬时表达实验结果支持该基因的表达丰度与花粉粒发芽存在正相关的关系。