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PyWRKY26和PybHLH3协同PyMYB114启动子调控红皮梨花青素的生物合成和运输

发布日期:2022-07-05 浏览次数:80


       PyWRKY26和PybHLH3协同PyMYB114启动子调控红皮梨花青素的生物合成和运输

       期刊:Horticulture Research

       影响因子:7.2912 (Q1)

       发表时间:2020.3

       通讯作者:Hualin Yi

       通讯作者单位:合肥工业大学

       https://doi.org/10.1038/s41438-020-0254-z


       一个梨,它为什么是红色的呢,Horticulture Research Most Read 文章带你对此有进一步的认识。同时文章涉及上下游调控、互作验证等经典实验设计,值得Copy对照。虽然涉及基因可能有点多,不过小编相信你不怕的,想发更高水平的文章,其实没有辣么难啦,先看看这篇文章学习一下吧。


研究背景:

       红梨因其鲜艳的外表和丰富的花色苷而备受青睐。花青素的生物合成由形成调节复合物的转录因子(TFs)控制。在红皮梨中,WRKY-TFs与花青素生物合成有重要关系,但WRKY-TFs参与调控红皮梨颜色形成的分子机制尚不清楚。以往的研究表明,梨PyMYB10和PyMYB114通过形成MBW转录复合物来连续调节花青素的生物合成,PyMYB114或PyMYB10与PybHLH3相互作用,显著增强花青素的生物合成。


技术路线:

涉及实验方法:

       转录组、RT-qPCR、瞬时表达、花青素含量检测、启动子克隆、酵母单杂、双荧光素酶互补实验、酵母双杂、萤火虫荧光素酶互补实验。

       利用转录组数据和生物信息学分析筛选WRKY候选基因

       从前人的转录组数据库中筛选了66个WRKY差异表达基因(DEG),并分析了‘Starkrimson’红皮梨及其绿色突变体在盛开后40、55和85天(DAFB)的转录组数据。通过热图分析、系统发育树构建、差异表达基因与其他参与花青素生物合成的基因(如WRKY TFs)的多肽序列比对分析,确定了候选研究基因PyWRKY26和PyWRKY31。


PyWRKY26/PyWRKY31与梨花青素积累及其他花青素生物合成调控因子的相关性研究


       结果表明,‘Starkrimson’红皮梨的花青素含量随果实发育而增加,且高于‘Jinzheng No. 1’。此外,‘Starkrimson’红皮梨中PyDFR、PyANS、PyUFGT、PyMYB10、PyMYB114、PybHLH3、PyWRKY26、PyWRKY31和PyGST的表达水平大大高于‘Jinzheng No. 1’梨(除了PyABC转运体、PyAVP1和PyAVP2)。花青素含量与花青素生物合成结构基因和TFs(如PyUFGT、PyGST、PyWRKY26、PyWRKY31、PyMYB114和PybHLH3)之间存在明显的正相关,花青素含量与PyABC转运体、PyAVP1和PyAVP2之间存在负相关。


PyWRKY26/PyWRKY31等TFs异源表达诱导烟草花青素积累

       为了验证PyWRKY31和PyWRKY26在花青素合成中的功能,将这些基因瞬时转化到烟草叶片中。注射空载体pSAK277作为阴性对照,当PyWRKY31或PyWRKY26单独和PyMYB114转化时未观察到色素沉着,在PyMYB114或PyMYB10与PybHLH3共转化后可观察到少量色素沉着。当PyWRKY26或PyWRKY31与PyMYB114、PyMYB10和PybHLH3共转化时,色素沉着显著增强。此外,通过色度计分析了烟叶中的花青素含量,L*、a*和b*值的变化与观察结果一致。当PyWRKY26/PyWRKY31参与共转化时,烟草中的花青素含量显著高于仅PyMYB114、PyMYB10和PybHLH3共转化时的花青素含量(P<0.01)。上述结果表明,PyWRKY26/PyWRKY31与PyMYB10、PyMYB114和PybHLH3共转化可显著促进花青素的合成。


(小编来了:嗯哼,基因来了,拿好你的小本本。)

(小编科普:L,a,b是代表物体颜色的色度值,也就是该颜色的色空间坐标,任何颜色都有唯一的坐标值;其中L:代表明暗度(黑白),a:代表红绿色,b代表黄蓝色;Eab是总色差(判定是否合格);其中a:如果是正值,说明样品比标准板偏亮;如果是负值,说明偏暗;a:如果仪器显示是正值,说明样板比标准偏红,如果负值,说明偏绿;b:如果是正值,说明样板比标准偏黄,如果负值,说明偏蓝。)


PyWRKY26/PyWRKY31与其他相关TFs的过度表达导致草莓容器中花青素的积累

       为了进一步确定PyWRKY26和PyWRKY31在花青素合成中的作用,对草莓花托器官进行了瞬时转化。结果表明,PyWRKY26/PyWRKY31与PyMYB10、PyMYB114、和PybHLH3的共转化可以显著促进草莓花托器官中花青素的生物合成。

草莓花青素生物合成和液泡转运相关基因表达水平的RT-qPCR分析

       RT-qPCR分析表明,四种TFs,PyMYB10、PyMYB114、PybHLH3和PyWRKY26/PyWRKY31的共转化通过上调FvDFR、FvANS、FvUFGT和FvGST基因的表达以及下调草莓花托中FvAVPs和FvABC转运基因的表达来增强花青素的合成和转运。


双荧光素酶报告系统验证转录调节复合物的相互作用

       使用双荧光素酶报告子分析来验证候选TFs与烟草中的结构基因(包括PyDFR、PyANS、PyUFGT、PyGST、PyABC转运体和PyAVP1/2)的相互作用。结果表明,PyMYB10和PyMYB114与PybHLH3共转化可诱导这些基因的启动子,另添加TF PyWRKY26/PyWRKY31可以显著增强PyDFR、PyANS、PyUFGT和PyGST启动子的反式激活活性。对于PyABC转运体和PyAVP1/2,添加PyWRKY26/PyWRKY31得到了相同的实验结果。这些结果表明PyWRKY26/PyWRKY31通过与PyMYB10+PyMYB114+PybHLH3复合物协同调节花青素的积累。


PyWRKY26和PybHLH3对PyMYB114启动子的激活活性验证

       克隆PyMYB114上游2 kb启动子,并通过烟草中的双荧光素酶报告子分析进行分析。与其他转录因子(包括PyWRKY31)相比,PyWRKY26和PybHLH3共转化对PyMYB114启动子序列具有更强的激活作用。酵母单杂交技术进一步验证了PybHLH3和PyWRKY26与PyMYB114启动子的结合。启动子结构分析表明,PlantCARE预测了多个顺式调控元件,进一步实验表明,PyWRKY26可以与S2片段结合。然而,没有检测到PybHLH3和PyMYB114启动子之间的直接关联。


PybHLH3与PyWRKY26相互作用的验证

       PybHLH3插入萤火虫荧光素酶(NLuc)的N端区域,而PyWRKY26与萤火虫荧光素酶(CLuc)的C端区域相连。NLuc-PybHLH3和CLuc-PyWRKY26载体的共表达显示出最强的释放荧光素酶活性的能力(P<0.01)。酵母双杂交实验验证了两者的互作。


OK!总结一下

        结论:在本研究中,通过转录组数据和生物信息学分析,筛选出TFs PyWRKY31和PyWRKY26作为控制花青素生物合成的候选基因。通过瞬时表达系统验证了PyWRKY31或PyWRKY26与其伴侣PyMYB10、PyMYB114和PybHLH3共转化后花青素积累的影响。RT-qPCR分析和双荧光素酶报告系统进一步证实,这种共转化激活了花青素生物合成中PyDFR、PyANS和PyUFGT的表达,以及花青素转运中PyGST的表达,而不是PyABC转运体和PyAVP。此外,共转化的PyWRKY26和PybHLH3可以与PyMYB114启动子结合,PyWRKY26直接激活PyMYB114的转录。此外,萤火虫荧光素酶互补和酵母双杂交(Y2H)分析证实,TF PyWRKY26可以与PybHLH3互作。这些结果表明,PyWRKY26和PybHLH3的互作可以协同PyMYB114启动子,促进红皮梨花青素的积累。本研究进一步加深了对花青素积累调控机制的理解,有助于改善红皮梨的外观。