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发布日期:2022-06-23 浏览次数:149


       在分子机制的研究中,蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了,作为生命活动的主要承担者,绝大多数的功能蛋白质通过与其它蛋白质或化合物相互作用,形成大分子化合物,从而发挥生物学功能。迄今已发展出了多种用于研究蛋白质互作的技术和方法。


       目前,研究蛋白质-蛋白质相互作用常用方法主要包括:酵母双杂交技术 (Y2H)、免疫共沉淀技术( Co-IP)、GST融合蛋白沉降技术(GST pull-down)及双分子荧光互补技术(BiFC),以及近几年来逐步广泛应用的荧光素酶互补技术(Luc)。


酵母双杂交技术(Y2H)

       酵母双杂(Y2H)是一种基于功能转录因子重构的PPIs体内检测方法。该系统是将待研究的两种蛋白质分别克隆(融合)到酵母表达质粒的转录激活因子(如GAL4等)的DNA结合结构域(DNA-BD)和转录激活域(AD)上,构建成融合表达载体。当转入相应酵母菌株后,若两个蛋白发生互作,则将使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近结合,再进一步与上游激活序列结合,激活相应报告基因的表达。


免疫共沉淀技术(Co-IP)

       免疫共沉淀(CO-Immunoprecipitation,CO-IP)是一种基于抗原与抗体的专一性结合的实验方法,用于确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用。原理是如果蛋白X与蛋白Z结合,那么当用抗体去结合蛋白X的时候,蛋白Z也能被拉下来,反之亦然。这种方法常用于检测两种目标蛋白质是否在体内结合,也可用于获得一种特定蛋白质新的互作蛋白,即把免疫共沉淀后得到的样品做蛋白组学,通过质谱对这个复合体中的所有成员进行鉴定。


GST融合蛋白沉降技术(GST pull-down)

       GST pull down(GST融合蛋白沉降技术)是体外检测蛋白相互作用的常用方法。基于GST(Glutathione-S-transferase,谷胱苷肽巯基转移酶)可以与谷胱甘肽(Glutathione,GSH)结合的原理。将GSH固定于琼脂糖珠,将已知蛋白X与GST融合表达,若存在与X蛋白互做的蛋白Y,则会形成“琼脂糖珠-GSH-GST-X-Y”复合物,与X蛋白互做的蛋白即可被分离并通过WB或质谱检测。



双分子荧光互补技术(BiFC)


       双分子荧光互补技术BiFC(Bimolecular Fluorescence Complementation),是体内检测蛋白相互作用的常用方法。借助于烟草的瞬时表达系统,通过具有相互作用亲和力的两个蛋白质,将分别与其相连的荧光蛋白片段拉近,组装成完整的荧光蛋白,从而产生荧光,直接反映蛋白质之间的相互作用,可视化是BiFC技术最大的特点。


荧光素酶互补技术(Luc)

       最初开发用于检测哺乳动物活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用,但后来被逐步用于植物的蛋白互作研究中。同样借助于烟草的瞬时表达系统,将待测的2个目的蛋白分别与荧光素酶蛋白NLuc和CLuc融合,当2个目标蛋白相互作用将NLuc和CLuc紧密结合,恢复荧光素酶的催化活性,促使荧光素酶底物氧化而发光。通过植物活体成像系统和高灵敏度发光检测仪检测生物发光的强度,从而对蛋白之间的相互作用进行定性和定量分析。


技术总结

       上述5种技术中应用最广泛的是酵母双杂交技术Y2H,它可以大规模筛选相互作用的蛋白对,然而其检测有一定的假阳性率和局限性。

       Co-IP则需要特定抗体,受如蛋白质提取、结合和洗涤方案等实验操作影响较大,使得每个实验室的结果往往是不同的。

       GST pulldown是用来验证蛋白的直接结合的,而Y2H和Co-IP结果则还有间接作用以及非特异性作用。Y2H、Co-IP和GST pull down是研究蛋白互做最常用的三种方法,一般Y2H常用来筛选,Co-IP和GST pulldown用来验证。

       BiFC相对简单,具有可视化的特点,已用于许多植物蛋白质-蛋白质相互作用研究,但由于细胞壁、叶绿体和其他细胞结构产生的自荧光引发的干扰,也使其在植物中的应用受限。

       新出现的荧光素酶互补技术简便、灵敏度高、定量,目前已获得很多文献的支持,可用于相互作用蛋白的瞬时表达或稳定的转基因表达,正逐步成为蛋白互作验证技术的重要成员。


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