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还在苦苦制备原生质体?一文带你快速解锁单细胞核测序

发布日期:2022-06-10 浏览次数:228

植物单细胞核时代|集思慧远单细胞核转录组测序为解决样本解离引发的问题提供完善的技术方案!!


       常规植物转录组学研究通常是将植物整个器官或组织均质化后测序,这种方法虽然有助于在器官或组织水平上解决许多生物学问题,但是难以识别每个细胞对转录丰度的贡献,无法了解稀有细胞类型或单个细胞中的转录过程。细胞捕获、测序技术和生物信息学的飞速发展使得单细胞转录组测序(Single-cell RNA-seq,scRNA-seq)成为可能,并不断发展和完善,目前已广泛应用于生物学和医学领域,并在植物学研究中显示出巨大的潜力。但其对于植物物种本身以及样本处理有着极高的要求。在植物中开展单细胞转录组研究有助于深入理解不同细胞类型在发育过程中的作用以及细胞间的调控网络。

       近年来,单细胞测序技术已成功应用于分离的拟南芥、玉米、水稻和番茄等物种的叶片、茎尖、花序和根原生质体。但是这一策略逐渐呈现出一些方法学挑战:

① 组织类型偏好(无法分析难解离的组织和冻存组织等);

② 解离过程中会诱导应激相关基因表达,造成一些转录偏好;

③ 组织解离时得到易于解离下来的细胞,敏感的细胞可能在解离时破碎,无法有效获取到组织中的所有细胞类型;

④ 目前商业化的单细胞平台都对细胞大小有限制等(一个植物细胞的大小可达到100μm,而大多数动物细胞范围在10-30μm不等)。


       为了克服这些困难,提出了一个简单而快速的替代策略:分离和使用植物单细胞核来获取植物细胞中有意义的转录组信息——单细胞核转录组测序(single-nuclei RNA sequencing)。




那么单细胞核转录组测序技术到底是一项什么样的技术?


       单细胞核转录组测序(Single Nuclei RNA Sequencing,snRNA-seq)区别于常规的单细胞转录组测序,对组织直接进行抽提细胞核,并用细胞核进行后续的转录组测序分析,建立整个组织器官中不同细胞类型的基因表达图谱,更加充分了解组织的细胞异质性和细胞的分化、发育状态与细胞功能机制。



       技术亮点:植物样本分离细胞核+流式细胞仪!!

       将大量的抽核碎片、团块、以及非细胞所属的RNA(Ambient RNA)通过物理学方法直接剔除!获得高质量细胞核悬液,保证较高的数据质量。


相比scRNA-seq技术它有哪些优势?


   1. 研究对象广,如冻存组织以及较难制备原生质体组织均可适用;

   2. 直接抽核,消化均匀,不具有偏好性,获取更全面的细胞类型,发现稀有细胞类型,挖掘新Marker基因;

   3. 避免组织解离过程诱导应激基因表达;

   4. 与scRNA-seq在细胞分群上趋于一致,具有类似的基因检测率


针对不同的样本类型该如何选择?


        已开展单细胞研究的组织类型主要集中在根、茎、叶、花、花粉等,其中研究最多的是根、茎、叶,而且主要是发育3-7日龄的幼嫩组织。


植物抽核单细胞测序样本准备:

1)条件允许的情况下,用原始的植物培养条件来寄送活体材料,如盆栽或组培苗形式寄送。

2)条件不允许的情况下,可以寄送冻存样本。从植物体上取新鲜幼嫩、生长旺盛的根部/叶片/花卉等研究目标组织,液氮速冻,干冰运输。

组织量的要求:组织量尽量达到1g以上。


这项技术目前在植物领域都有哪些具体的应用案例?



最新研究:玉米单细胞核转录组全面揭示气孔运动和发育的分子机制

题目:The maize single-nucleus transcriptome comprehensively describes signaling networks governing movement and development of grass stomata

期刊:The Plant Cell

影响因子:9.618

发表时间:2022.6

DOI:https://doi.org/10.1093/plcell/koac047


本研究提出:我们是否全面了解单子叶植物气孔快速应答及发育的分子机制?气孔运动与发育过程中的关键因子是什么,如膜通道,关键信号转导通路的组成部分以及保卫细胞和辅助细胞细胞壁特异蛋白质?


       植物气孔的独特形态使其能够快速响应环境变化。解读这些反应的依据对于改善粮食安全至关重要。针对以上问题本研究利用荧光激活细胞分选技术从玉米表皮细胞中分离了碘化丙碇染色的细胞核并开发了高通量单细胞核RNA测序的植物平台,利用该平台从玉米表皮富集组织的33,098个细胞核中鉴定成熟和发育中气孔的细胞类型。保卫细胞(GCs)和辅助细胞(SCs)除了编码转运蛋白的基因外,在脱落酸、CO2、Ca2+、淀粉代谢、蓝光信号转导途径和影响细胞壁可塑性的基因表达上存在差异,表明GCs和SCs在气孔发育和哑铃状保卫细胞形成过程中存在更复杂的关系。通过与MUTE 缺陷突变体气孔发育的bulk RNA-seq 数据比较,确定了幼嫩组织中气孔发育轨迹,并阐明了气孔发育的关键参与因素。利用相同技术分析了玉米叶基部的样品,得到了参与单子叶植物气孔发育的新的候选基因。从这些候选基因中,研究鉴定了在哑铃状保卫细胞的发育和成熟过程中发挥重要作用的细胞壁相关基因。

       从单细胞核转录组数据得出的假设仍需功能验证实验进行证实。玉米气孔与其它单子叶作物转录组学比较将为哑铃状气孔细胞进化机制研究提供更深入的见解。

       玉米表皮细胞类型鉴定。A.细胞亚群UMAP可视化;B.标记基因在各细胞亚群表达气泡图;C/D.表皮中ZmGRP6(Zm00001d045877)和ZmSCS1(Zm00001d014325)的表达。

 

构建可能参与玉米气孔运动的细胞类型特异性基因模型

       与气孔运动有关的已知基因或同源基因。非信号阳离子/阴离子和信号分子的转运体分别用蓝色和橙色表示。细胞壁可塑性基因以灰色显示。GCs和SCs中ABA、CO2、C a2+和蓝光的信号模块通过不同的背景色表示



基于单核RNA测序数据进行空间重建的拟南芥花分生组织3D基因表达图谱


   题目:A 3D gene expression atlas of the floral meristem based on spatial reconstruction of single nucleus RNA sequencing data

   期刊:Nature communications

   影响因子:14.912

   发表时间:2022.5

   DOI:https://doi.org/10.1038/s41467-022-30177-y


       为了在单细胞水平上获得拟南芥花分生组织中全基因组的基因表达谱,作者使用同步花诱导系统收集来自花卉发育的第5阶段(DEX诱导后4天)花分生组织。通过荧光激活DAPI染色细胞核分选(FANS)收集细胞核进行单细胞核测序。本文选择分离细胞核而不是原生质体,以避免原生质体可能产生的转录组变化。共识别出7716个单核转录组,每个核平均表达1110个基因。结合已发表的标记基因确定了12个细胞簇并进行了注释。这些细胞簇包含了分生组织中存在的主要组织类型。后用单细胞核RNA-seq与基于显微镜的三维空间重建相结合的方法,重建了3D花分生组织单个细胞的全基因组基因表达模式, 展示了空间重建的单细胞转录组图谱在理解植物形态发生方面的能力。



拟南芥花分生组织的单核RNA测序

a. 与第5阶段花分生组织bulk RNA-seq与snRNA-seq中的所有细胞核估计的基因表达再现性(R=0.88);b.拟南芥花分生组织UMAP图和聚类;c.已知花标记基因在已识别snRNA序列簇上的平均相对表达。



单细胞核转录组解析番茄茎尖的时空发育轨迹

题目:Single-nucleus RNA-seq resolves spatiotemporal developmental trajectories in the tomato shoot apex

发表期刊:BioRxiv

发表时间:2020.9

DOI: https://doi.org/10.1101/2020.09.20.305029


       本研究利用snRNA-seq技术获得的高分辨率表达图谱鉴定了番茄茎尖组织和发育阶段的不同细胞类型。经过质量控制和过滤,获得了13377个核,检测基因数为21402。为了评估snRNA-seq数据的可重复性和敏感性,用番茄茎尖进行Bulk RNA-seq。snRNA-seq检测到的基因,有92.3%可以通过Bulk RNA-seq检测到(FPKM > 1),表明snRNA-seq具有较高的敏感性,snRNA-seq和Bulk RNA-seq的相关性达到0.9,表明具有很高的重现性。确定了16个细胞簇并进行了注释,细胞发育轨迹分析表明起始于分生组织细胞,叶肉细胞与脉管系统细胞明显分离,随后,脉管系统细胞分离为木质部细胞和韧皮部细胞此外,作者还确定了关键的发育调控因子并揭示了它们的等级。综上所述,该研究证明了snRNA-seq在植物研究中的作用,并提供了一个前所未有的异质性茎叶细胞的时空基因表达图谱。

snRNA-seq建立番茄茎尖细胞图谱



总结

       细胞壁的存在极大阻碍单细胞转录组学在植物研究中的应用。对此开发snRNA-Seq技术 ,为特殊样品(如冷冻组织)、难制备原生质体样本的单细胞研究提供新的途径,无细胞粒径局限。snRNA-Seq分析细胞核内的RNA,可以解释相应的生物学信息;不仅可以提高RNA的捕获能力,同时可以得到更多的稀有细胞类型;snRNA-seq解决了scRNA-seq中固有的一些问题,能够获得更为准确可靠的结果。


       集思慧远可为您提供单细胞核转录组测序从实验设计到数据分析到文章发表的一整套技术支持,一线分析人员有着10年以上的工作经验,无论是基础分析还是高级分析都能为您一网打尽。如果您想获得更多的细胞类型;如果您想获得更真实的细胞转录信息;如果时您无法制备原生质体进行单细胞测序;如果您想充分利用之前冻存的组织样品进行研究。欢迎来电咨询:025-85381280,我们资深产品应用专家为您竭诚服务!