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基于叶绿体基因组学分析重要药用贝母属的进化关系和筛选

发布日期:2021-12-25 浏览次数:883

文章简介

2021年12月16日,西南交通大学廖海老师团队在《Peer J》(Q2=2.984)发表题为“Identification of evolutionary relationships and DNA markers in the medicinally important genus Fritillaria based on chloroplast genomics”的研究成果。该研究依托高通量测序技术,完成对川贝母(暗紫贝母、梭砂贝母和甘肃贝母)和中华贝母叶绿体全基因组的测序及分析工作,揭示药用贝母属植物的系统进化规律和筛选川贝母的特异性分子标记。

原文链接:https://peerj.com/articles/1261202

研究背景

川贝母 (Fritillariae Cirrhosae Bulbus ),本品为百合科植物川贝母(卷叶贝母)(Fritilaria cirrhosa D.Don )、暗紫贝母 (Fritilaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia ) 、甘肃贝母( Fritilaria przewalskii Maxim )、梭砂贝母(Fritilaria delavayi Franch )、太白贝母(Fritilaria taipaiensis P. Y. Li )或瓦布贝母(Fritilaria unibracteata Hsiao et K. C. Hsiavar. Wabuensis (S. Y. Tanget S. C. Yue) Z. D. Liu,S. Wang et S. C. Chen ) 的干燥鳞茎。按性状不同分别习称“松贝”、“青贝”、“炉贝”和“栽培品”。暗紫贝母主产于四川阿坝藏族自治州,是松贝的主流品种,松贝品质最优;卷叶贝母(川贝母)、甘肃贝母分布较广,不以阿坝地区为主产地,被认为是青贝的植物来源,青贝仅次于松贝;炉贝主产于四川甘孜藏族自治州、西藏和云南,一般来源植物为梭砂贝母,品质次于松贝、青贝。川贝母为我国可用于保健食品的名贵传统中药材,有清热润肺、化痰止咳、散结消痈之功效。近年来,由于川贝母疗效显著,需求量大,预计川贝母年需求量将接近200万公斤,导致货源长期紧缺,价格比较昂贵。目前作为商品流通的川贝母植物种来源,远远超过药典所载的类别,不同基原种川贝母的混乱使用,严重影响了其临床疗效和科学研究的可靠性,并且阻碍川贝母作为道地药材的产业化发展。通过文献调研以及本实验室前期工作得知目前鉴别川贝母与其他非川贝母伪混品已经有较为方便可靠方法,但是区分鉴定川贝母6种基原植物的研究未见报道。叶绿体(Chloroplast)是植物细胞内最重要、最普遍的质体,也是细胞内具有自主遗传信息的半自主细胞器,更是进行光合作用和生物合成的关键场所,被普遍认为起源于内共生的蓝藻。在大多数被子植物中,叶绿体基因组为母系遗传,其重组率低、核苷酸置换率适中,具有良好的系统发育重建潜力。近年来,随着新一代测序技术的迅速发展和测序成本的下降,已发表的叶绿体基因组数量急剧增加。叶绿体基因组的遗传信息在解决系统发育位置和不同物种间的亲缘关系方面做出了重要贡献,同时也被广泛用于揭示物种起源和估计各谱系间的分歧时间。

研究思路


材料和方法

实验材料

青海省西宁市互助县采集的暗紫贝母、梭砂贝母、甘肃贝母和中华贝母新鲜植物叶片

实验设计

实验流程按照Illumina公司提供的标准protocol执行,包括样品质量检测、文库构建、文库质量检测和文库测序等流程,完成因组分析(叶绿体基因结构注释、IRscope分析、核酸多样性分析和系统进化树的构建等方面)。

测序平台

Illumina NovaSeq高通量测序平台本研究的高通量测序和部分数据分析工作由南京集思慧远生物科技有限公司完成。

研究结果


贝母叶绿体基因组注释图谱及边界分析通过四种贝母的叶绿体基因组结构比较,我们发现暗紫贝母缺少rps16基因,与其他三种贝母的差异较大。不同基原的川贝母在基因组结构存在差异,确定这些差异的保守性与否,来判断其是否可作为特异性标记位点。

    此外,通过比较rps19基因和ycf1基因在LSC/IRb、IRb/SSC和SSC/IRa区域上的差异,可以发现同为贝母属的物种,它们在IR区域收缩和扩展的差异较小,而在非同属的物种间比较起来差异明显,不仅仅是基因分布碱基数的差异,更多的是基因片段大小的较大差异,从而使不同物种在基因组的大小上存在差异。

核酸多样性分析

    利用滑动窗口分析,最终提取16个区域,计算核苷酸变异率,pi值为0.0104(rpl12)至0.0159(ycf1)。鉴定出10个分布最广的区域,可作为贝母属系统发育分析和物种鉴定的潜在分子标记,见图2-6。这些区域包括ycf1、trnL-UAA、trnF-GAA、ndhD、trnN-GUU-trnR-ACG、trnE-UUC-trnT-GGU、、trnN-GUU、psbM-trnD-GUC、atpI和rps19。其中ycf1基因的分化程度最高,本研究又通过对11种药用贝母的ycf1基因进行比对,寻找有希望的分子标记进行物种鉴定。结果发现平贝母、伊犁贝母、太白贝母、新疆贝母、浙贝母、湖北贝母、暗紫贝母和梭砂贝母的种特异性分子标记。

系统进化树的构建及分析

    首先采用最大自然数法基于61种贝母及其近、远缘物种的matK、psbA-trnH和rpl16三种常见DNA条形码序列和利用变异度最大的ycf1基因序列构建系统发育树。结果表明,matK、psbA-trnH和rpl16获得了较弱支持树,而基于ycf1基因的系统发育树则获得了中等支持树,分别有50%(NJ树)和60%(ML树)的分枝获得了超过90 BP的bootstrap值。

    采用ML法基于61种贝母及其近、远缘物种的叶绿体全基因组序列构建系统进化树,矩阵包括27种贝母属植物、26种百合属植物、3种大百合属植物和5种老鸦瓣属植物。在ML树中,贝母群和百合群得到强支持(100 BP),是大百合属的姐妹群。在系统进化树种百合是单系(100 BP),是贝母的姐妹种。此外,百合与贝母出现嵌套情况,并有适度的中度支持(75 BP)而不是Day等先前结果(53 BP)。贝母属是最大的亚属,属于副门亚属,除F. maximowiczii (Liliorhiza亚属)外,其余亚属均为副生亚属。在进化枝A中,F. davidii与其余的欧亚物种(100 BP)是连续的姐妹类群,它们分裂成两个支持良好的进化枝。支系A1与中国北部地区的贝母亚属两种为姊妹,属单型亚属Rhinopetalum (F. karelinii)。姊妹枝(A2)由其余22种组成,可分为两个亚枝(100 BP)。B1亚枝包含中东和中亚地区的Theresia (F. persica)亚属和Petilium (F. eduardii)亚属,B2亚枝包含华南地区的15种贝母亚属和新疆平原地区的5种(F. tortifolia、F. verticillata、F. yuminensis、F. pallidiflora and F.walujewii)。从我们构建的两种进化树上来看,《中国药典》提及的11种最有药用价值贝母,它们不在单一系群中,平贝母是从其他10种中分离出来的。总体而言,基于叶绿体全基因组的系统发育树得到了高度支持,其中91% (53/58)分支的bootstrap值超过90 BP。因此,与四个部分区域比较,叶绿体全基因组获得了高度可靠的系统发育树。

    基于《中国药典》上提及的11种最有药用价值的贝母(暗紫贝母、梭砂贝母、太白贝母、甘肃贝母、卷叶贝母、瓦布贝母、浙贝母、平贝母、湖北贝母、伊犁贝母和新疆贝母),我们绘制了这些贝母物种的分布区。我国贝母分布主要集中在四个地区,分别是以新疆贝母、伊犁贝母等5个品种为主的新疆地区、以川贝母、华西贝母、中华贝母和渝中贝母等11个品种为主的横断山脉地区、以浙贝母、湖北贝母和安徽贝母为主的华中地区和以平贝母为主的东北地区。这些不同贝母主产地分布同样对应了图2-12中的它们在进化树各个枝的分化,贝母属植物的聚类结果明显受到其分布区域的影响,说明贝母属物种系统进化与其地理聚类分布也是有一定关联性的。

研究结论

    本研究通过二代测序获得了四种贝母的叶绿体基因组数据,并完成和统计了它们的组装和注释结果,得出:四种贝母的基因组大小差异范围在864-967 bp,暗紫贝母与其他三种贝母的差异较大并发现其缺少了rps16这个基因;在三个分区上,LSC区域差异较大,是值得探讨和深入研究的区域,有望在此区域筛选出可做分子标记的位点。又通过比较17种贝母及其近缘物种叶绿体基因组中rps19基因和ycf1基因在LSC/IRb、IRb/SSC和SSC/IRa边界区域上的差异,发现同为贝母属的物种,它们在IR区域收缩和扩展的差异较小,而在非同属的物种间比较起来基因片段有较大差异,从而使不同物种在基因组的大小上存在差异。

    比对全基因组未重复的113个基因并计算出它们的pi值,排名前10的基因有:ycf15、rrn5、tRNA-AAU、rrn4.5、rpl36、psbZ、matK、rrn16、tRNA-GAU和rrn23,这些基因的所在区域的pi值较大,变异度较大。通过比对12种市面常见的贝母叶绿体全基因组序列,并计算了它们之间的pi值,进行滑窗分析,最终提取16个区域,pi值为0.0104(rpl12)至0.0159(ycf1)。鉴定出10个分布最广的区域:ycf1、trnL-UAA、trnF-GAA、ndhD、trnN-GUU-trnR-ACG、trnE-UUC-trnT-GGU、、trnN-GUU、psbM-trnD-GUC、atpI和rps19。其中ycf1基因的分化程度最高,本研究又通过对11种药用贝母的ycf1基因进行比对,寻找有希望的分子标记进行物种鉴定。结果发现了平贝母、伊犁贝母、太白贝母、新疆贝母、浙贝母、湖北贝母、暗紫贝母和梭砂贝母的种特异性分子标记。平贝母(78个SNPs和9个indels)的分子标记数量最多,而暗紫贝母(2个SNPs)、瓦布贝母(2个SNPs)和梭砂贝母(2个SNPs和2个indels)的分子标记数量最少。

    本研究基于贝母的叶绿体基因组数据,利用ML法建树,发现完整叶绿体序列的系统进化树明显优于一些常见DNA条形码(psbA-trnH,ITS2,matK等)的聚类效果,且具有更好的分辨效果,并得出贝母属植物与百合属植物亲缘关系最近的结论,符合物种进化规律。贝母属植物的聚类结果明显受到其分布区域的影响,在中国有4个贝母植物的栽培热点区域,分别是:以伊犁贝母、新疆贝母等5个品种为主的新疆地区;以川贝母、华西贝母、中华贝母、渝中贝母等11个品种为主的横断山脉地区;以浙贝母、湖北贝母与安徽贝母为主的华中地区;以平贝母为主的东北地区。

小编总结

    贝母是重要的药用植物,川贝母又被称为“止咳圣药”,疗效显著,年需求量大,近年来市面出现的混伪品较多,导致了药用市场紊乱。本课题组基于叶绿体基因组信息,构建贝母属植物系统进化树,分析其进化关系及其在中国的聚类分布规律,接而合理设计并筛选高特异性分子标记,用于快速鉴定川贝母,确保原料药材的准确投放和临床用药安全。公司目前业务涵盖各组学测序服务、生理生化检测服务、分子实验外包服务以及生物大数据分析服务。主要产品涉及基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学、表观组学、微生物组学等六大组学领域。公司2017年获得国家高新技术企业称号。公司自主开发各类实验技术以及数据分析算法,已获批27项软件著作权、受理专利4项。已为国内500多家高校、农科院、医院、医学院、药企等各类研究机构提供过科研服务。