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文献解读| PBJ 利用CRISPR/Cas9批量发掘玉米雄性不育转录因子

发布日期:2021-06-10 浏览次数:443

      2021年3月27日,北京科技大学万向元教授团队在著名国际期刊Plant Biotechnology Journal在线发表了题为“CRISPR/Cas9-based Discovery of Maize Transcription Factors Regulating Male Sterility and Their Functional Conservation in Plants”的研究论文。该研究整合利用生物信息学和花药转录组分析以及CRISPR/Cas9技术,建立起一种快速精准创制玉米雄性不育突变体和发掘GMS TF基因的新方法。



     

      鉴定雄性不育 (GMS) 基因对于揭示植物雄性发育调控机理与作物育种具有重要意义。其中GMS TF基因在雄性发育过程中发挥重要作用,构成转录调控通路的主线。然而,与拟南芥和水稻相比,已发现的玉米GMS TF基因极少,严重制约了玉米雄性发育机制的深度解析和雄性不育分子遗传调控网络的构建。因此,批量化创制玉米GMS TF突变体并解析基因功能机理,对深入理解玉米雄性发育生物学过程尤为重要。



全文解析

   为了鉴定更多的玉米GMS TF,团队首先对来自 11 个发育时期(S5 至 S12)的三个自交系(B73、Zheng58 和 M6007)的玉米花药进行了转录组测序,鉴定出1100个在三个自交系中共有的/时期差异表达(Stage-DE)TF基因(图1),既包括6个之前已报导的玉米GMS TF基因,也包括在拟南芥、水稻和其他植物中报道的GMS TF基因的玉米同源基因,表明了该预测方法的可靠性



图1 转录组鉴定3种遗传背景玉米花药的Stage-DE TF基因



      基于上述1100个Stage-DE TF基因,结合其它植物中已报道的GMS基因信息,选取14个玉米雄性发育相关转录因子基因进行CRISPR/Cas9定点突变,最终获得12个玉米GMS TF新基因(ZmTGA9-1/-2/-3、ZmTGA10、ZmbHLH122、ZmbHLH51、ZmMYB84、ZmMYB33-1/-2、ZmPHD11和 ZmLBD-10/-27)及其对应的纯合GMS突变体。大部分GMS TF直系同源基因在花药和花粉发育过程中的功能相对保守,但也有部分基因存在功能冗余,如:ZmTGA9-1/-2/-3三基因突变体和ZmMYB33-1/-2双基因突变体表现出完全雄性不育,而双基因或单基因突变均表现雄性可育(图2)。


图2. 基于CRISPR/Cas9技术创制的玉米ZmTGA9-1/-2/-3三基因突变体表现雄性不育

     

      此外,通过RT-qPCR发现ZmbHLH122和ZmbHLH51两个基因在玉米不同发育期具有重叠表达模式,为了研究这两个基因的基因调控和蛋白质相互作用,团队进行了双荧光素酶报告基因检测、Co-IP 和 BiFC 测定。结果表明,ZmbHLH122可直接激活ZmbHLH51的表达并与其相互作用,形成在玉米雄性育性中发挥功能的异源二聚体(图3)。


图3  ZmbHLH51 和 ZmbHLH122 之间的相互作用



      为了进一步研究玉米GMS TF基因在控制花药发育和花粉形成中的作用,团队根据本研究新发现的12个和已报道的6个玉米GMS TF基因,研究其在三种不同遗传背景的玉米花药转录组中的表达模式,并用RT-qPCR验证了转录组的结果(图4)。

      与拟南芥和水稻相似,玉米花药发育分为14个时期,对应4个发育阶段。黄色框为已报道的水稻和拟南芥核心调控通路中关键GMS TF,推测玉米花药中可能也存在类似的核心调控途径(ZmMs32-ZmMs9-ZmbHLH51/122-ZmMYB84-ZmMs7),控制玉米花药绒毡层发育和花粉壁的形成,为深入解析雄性不育分子机理和构建遗传调控网络奠定基础。



图4  18个时期差异表达的GMS TF基因的表达模式




创新点总结

      之前报道的绝大部分GMS基因是通过正向遗传学方法克隆获得,需要依赖GMS突变体,经过基因定位和图位克隆,周期长、效率低,且在研究功能冗余基因方面存在局限性。该研究整合利用生物信息学和花药转录组分析以及CRISPR/Cas9技术,建立起一种快速精准创制玉米雄性不育突变体和发掘GMS TF基因的新方法。




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