服务热线:025-85381280 / 18551854236
文献解读

集思慧远客户发表《拟南芥激酶相关蛋白磷酸酶KAPP与蛋白激酶SnRK2.2/2.3/2.6相互作用,负调控脱落酸信号》

发布日期:2020-06-09 浏览次数:471

脱落酸(ABA)是一种重要的植物激素,可调节许多生理过程,包括器官脱落,种子发芽,幼苗早期生长以及对干旱和盐分等各种不利条件的适应性反应。

激酶相关蛋白磷酸酶(KAPP)属于2C型蛋白磷酸酶(PP2Cs)家族,催化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的去磷酸化,如受体样蛋白激酶(RLKs),在植物信号转导途径的一个子集中发挥重要作用。众所周知,KAPP与一系列RLKs相互作用,调节各种信号通路,如花分生组织中的细胞分化、防御反应和盐反应通路。

The Arabidopsis kinase-associated protein phosphatase KAPP , interacting with protein kinases SnRK2.2/2.3/2.6, negatively regulates abscisic acid signaling

期刊:Plant Molecular Biology

IF=3.928


材料与方法

实验采用拟南芥生态型Col-0作为野生型对照。

突变体的获得:

kapp-1:购买于ABRC

kapp-2:基因编辑,37bp丢失,并导致移码突变


结果解读

1、KAPP突变使种子萌发和幼苗生长对ABA的敏感性增强

拟南芥两个KAPP功能突变体kapp-1和kapp-2,在ABA诱导的种子萌发抑制和萌发后生长停滞中,表现出更高的ABA敏感性。也就表明KAPP负调节ABA诱导的种子萌发抑制和幼苗生长。



2、在ABA、NaCl和甘露醇作用下,KAPP转录水平升高,KAPP在不同器官中广泛表达

为了进一步分析KAPP的表达模式和生理功能,荧光定量PCR检测ABA胁迫、盐胁迫、甘露醇胁迫下,KAPP在不同时间段的表达情况。表明KAPP参与调节ABA、盐、渗透胁迫响应。利用KAPP启动子驱动的转基因株系GUS表达进行组织化学分析,我们发现除了干种子外,几乎所有器官/组织中都检测到了GUS活性(图2b)。KAPP在不同器官/组织和不同发育时期的广泛表达表明KAPP可能参与了多种生物学过程和生长发育过程。


3、KAPP与SnRK2.2/2.3/2.6互作分析

KAPP与SnRK2.2,SnRK2.3和SnRK2.6互作分析:GST-pull-down、荧光素酶互补实验、酵母双杂实验


这些结果表明KAPP与SnRK2.2/2.3/2.6相互作用,KAPP的KI结构域在相互作用中起重要作用。


4、KAPP与SnRK2.2/2.3/2.6的共定位

为了提供进一步的证据来证明KAPP与植物细胞中SnRK2.2 / 2.3 / 2.6相互作用的可能性,作者在烟草中进行了共定位实验,以检测它们的定位关系。共聚焦图像表明:在细胞膜区域观察到KAPP-GFP的绿色荧光,而在细胞质处仅发现SnRK2.2 / 2.3 / 2.6-RFP或RFP的红色荧光。表明KAPP在细胞膜上表达。


5、KAPP与SnRK2.2和SnRK2.3在功能上相互作用

我们利用CRISPR/Cas9基因编辑SnRK2.2 SnRK2.3双突变背景下的KAPP基因,得到SnRK2.2 SnRK2.3 kapp -3三突变体,其中一个碱基缺失在KAPP的第二个外显子上 。SnRK2.2 SnRK2.3 kapp -3三突变体在ABA诱导的幼苗生长抑制中表现出与SnRK2.2 SnRK2.3双突变体类似的ABA不敏感表型,说明KAPP在ABA信号途经中作用于SnRK2.2和SnRK2.3上游(图5a, b)。


6、KAPP的突变改变转录本的积累概况

为进一步解释KAPP -1对ABA的超敏感性,并确定KAPP在调控总体基因表达中的功能,我们进行了RNA-seq,比较KAPP -1突变体与野生型Col-0(WT)在正常生长条件下或ABA处理下的转录组变化。与对照组相比,ABA处理WT中有1869个上调基因和3190个下调基因,而KAPP -1中有1710个上调基因和3043个下调基因,其中有1058个上调基因和2143个下调基因重叠。ABA处理后,与WT相比,KAPP -1植株共显著上调328个基因,下调502个基因。结果进一步支持了KAPP在ABA信号途径中的负调节作用。


qPCR分析验证,结果表明ABA处理下kapp-1中EM1、RAB18、COR15A基因的表达水平增加。这些结果与KAPP在ABA信号转导中的负调控作用基本一致。


在本篇文章中,作者集结了突变体+PCR验证+荧光定量PCR+胁迫处理+表型观察+转基因+GUS染色+荧光互补实验+GST-pull-down+酵母双杂+亚细胞定位+基因敲除+胁迫处理+表型鉴定+转录组测序+荧光定量检测。发现KAPP对ABA介导的种子萌发和幼苗早期生长有负相关作用。KAPP与SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6进行物理交互,并在SnRK2.2和SnRK2.3的上游起作用。这些结果表明,KAPP负调控植物对ABA的响应,有助于理解复杂的ABA信号机制。


分子实验在基因功能研究中的作用研究中,我们整体的实验思路:

总体思路:材料明确→目的明确→基因明确→表达分析→功能研究→机理研究

实验手段:如何处理材料、如何获得基因、如何表达分析、如何研究功能、如何研究机理

倾向性:短平快与高水平文章



集思慧远可开展以下分子实验:

1.    扩大群体,进行精细定位  您提供群体,我们用KASP标记来精细定位

2.    基因克隆 克隆基因CDS全长

3.    原核表达、真核表达

4.    过表达(如有遗传转化体系,用该物种体系,如果没有,推荐拟南芥、烟草)

5.    VIGS

6.    RNA干扰

7.    基因敲除(必须在本研究物种,其中基因敲除必须要有基因组信息,否则投稿被拒概率大)

8.    转基因/基因编辑

9.    Western Blot、Southern Blot、Northern Blot

10.    亚细胞定位(观察基因表达位置)

11.    酵母双杂 寻找蛋白互作关系(KEGG通路、蛋白互作网络预测、文献等),进行蛋白互作验证,

12.    酵母单杂寻找蛋白与DNA互作关系

13.    双分子荧光互补实验

14.    co-IP

15.    EMSA(验证蛋白与核酸互作)