服务热线:025-85381280 / 18551854236
技术支持

韩国国产大豆代谢组学性状的高度地理特异性

发布日期:2019-12-11 浏览次数:815


摘要

在分子水平上对农产品进行分类和表征是重要的,但对基因分型通常是不可行的,特别是对于具有多种变种和地方品种的大豆。另外,代谢特征(营养价值的决定因素)可以是良好的分子指标,它反映了种植区域依赖的因素,例如气候和土壤。

因此,我们分析了在7个不同省份(代表产区)种植的韩国大豆的综合代谢谱,并探讨了与地理特征的潜在关联。使用气相色谱飞行时间质谱(GC-TOF MS)和液相色谱Orbitrap质谱(LC-Orbitrap MS)对总共210种初级和次级代谢物进行了分析。尽管大豆品种存在部分异质性,但基于多元统计数据的代谢组学表型分析表明,大豆的化学成分特征主要受区域特异性的控制。OPLS-DA模型提出了由5种代谢物(色氨酸、丙二酰染料木苷、丙二酰大豆苷、N-乙酰鸟氨酸和烯赖氨酸)组成的生物标志物簇(AUCS=0.870~1.0)。最具特色的代谢图谱是群山Gunsan(中西部海岸)和大邱Daegu(东南内陆地区)的大豆,它们分别以异黄酮和氨基酸含量最高为特征。对地理数据的进一步询问表明,区域特定代谢特征与一般土壤结构和气候特征(总降雨量和平均年温度)之间存在关联。

1引言

大豆是一种广泛种植的农产品,其食用豆在许多亚洲国家被用作主食、蛋白质和脂质的主要来源。大豆还富含一系列次生代谢物,这些物质已被证明对心血管疾病具有药理作用,例如:骨质疏松症、乳腺癌和前列腺癌和老年痴呆症。与其他农作物一样,营养成分因多种汇合因素而异。例如,具有不同基因型的不同品种可能是导致特征基因表达和代谢活动的关键因素。此外,大豆可能会得益于候和土壤等外部因素,这些因素也可能对大豆的代谢特性产生重大影响。有关大豆品种的信息对于全面评估其组成特性至关重要,但是,要遵循谱系是非常困难的,尤其是在已经注册了178个大豆品种的韩国。此外,据报道,大豆品种的市场寿命很短。例如,提交给大豆品种信息计划(美国伊利诺伊州大豆协会支持的计划)的品种中,有一半以上是新品种。当然,事实导致对大豆原产地确定的限制,最近韩国已将其添加到标签强制性清单中。在这种情况下,根据地理区域分类对大豆进行代谢表征似乎是最合适的方法之一。中国大豆的代谢产物谱研究已有报道,但其代谢产物受挥发性物质或少量异黄酮和花青素的限制。最近的一项研究报告了基于核磁共振的代谢物谱,结合地理特征的综合分析,但在韩国国内地区是在大豆叶片而不是大豆上。

因此,这项工作的主要目的是为表征韩国7个不同生长省份国内种植的大豆的代谢特性提供全面的信息和强大的平台。通过将GC-TOF MSLC-Orbitrap MS与先进的统计方法结合使用,我们获得了210种主要和次要代谢物图谱,这些图谱显示了区域特异性和假定的地理特征。

2材料与方法

2.1材料

黄豆苷元,黄豆苷,染料木素,染料木苷,黄豆黄苷,黄豆黄素苷,槲皮素和大豆皂甙I购自Sigma-Aldrich作为标准正化合物。LC-MS级甲醇,2-丙醇,乙腈,水和甲酸购自Thermo Fisher Scientific

2.2大豆样品采集

2015年(5月至11月)种植的大豆样本是从韩国7个省(代表性生产区)的当地农场收集的,这些农场存放在国家农产品质量管理局,目的是区分种植来源。该地区(单一品种或混合品种)包括Paju(Jangdanbaekmok 100%)Inje(Danwon 70%Cheonga 30%)Boeun(Danwon 100%)Gunsan(Danwon 70%Seopung 30%)Gangjin(Taekwang 100%)Daegu(Danwon 70%、野生型30%)Hamyang(Danwon 40%Taewang 40%、野生型20%)(S1)

2.3大豆代谢物提取

每组3个生物学重复,冷冻干燥后研磨,置于-80℃保存。

2.4总黄酮含量及抗氧化活性测定

对原方法稍作修改,用比色法测定总黄酮含量,在510nm处测定反应物的吸光度。这些程序重复了三遍。槲皮素标准溶液(4050607080μg/mL)的校准曲线以槲皮素等量(QEs)确定,数据表示为每1克干重毫克QEmg QE /g)。

总抗氧化能力使用OxiTeC总抗氧化能力测定试剂盒(BiMax,韩国)制造商的协议。

2.5地理和气候数据

月总降雨量(mm)和平均温度(°C)的数据来自韩国气象局(20155月至11月)[http://www.kma.go.kr/index.jsp](图S2AC)。关于省级土壤质地的信息是从美国农业部(USDA)获得的(图S2E)。

2.6初级代谢物的GC-TOF MS分析

检测平台:Agilent 7890B-Leco Pegasus HT;扫描范围:85-500m/z

分析软件:Chroma TOF software 4.50 version

2.7次级代谢物的LC-Orbitrap MS分析

检测平台:Waters Acquity UPLC-Q-Exactive Plus instrument (Thermo Fisher Scientifific, MA, USA);扫描范围:100-1200Da

分析软件:Xcalibur 4.0Q-Exactive Tune software

2.8统计分析

SIMCA 14用于PCAOPLS-DAROC分析;基于超几何学测试和相对中间性中心性进行通路过度表达分析,并使用MetaboAnalyst中实现的模块进行模式搜索以确定特定区域的代谢产物。基于基于pearson相关和平均连锁方法,使用Multi Experiment Viewer进行层次聚类分析和热图可视化。利用ChemRICH进行了化学富集计算和图形可视化。简单地说,该方法比较了由结构相似性和化学本体(中间主题词数据库)构建的化学簇的统计显著性。用Kolmogorov-smirnov检验评价统计学意义。

3结果

3.1总黄酮含量和抗氧化活性根据栽培区的不同而不同

1A对总黄酮含量进行了分析和总结。各地区含量差异不显著,在61.366.5mg QE/g之间,但群山Gunsan的含量略低(54.5mg QE/gp<0.03)。Trolox等效抗氧化能力测定为总抗氧化活性。在大邱Daegu种植的大豆(图1B)的活性最高,其次是坡州Paju、麟蹄Inje和报恩Boeun地区。位于韩国南部的群山Gunsan和康津Gangjin的活动最低。


1 不同地区栽培大豆总黄酮含量(A)和抗氧化活性(B

注:不同字母(abc)显示了不同区域间的显著差异(p<0.05)。

3.2韩国7个不同地区栽培大豆的综合代谢物判别模型

从在韩国7个不同地区栽培的大豆中获得了初级和次级代谢物图谱。GC-TOFMS分析得到900个代谢特征,其中92个化合物是基于Binbase算法进行结构鉴定的。利用UPLC-OrbitrapMS对次生代谢物进行了适应性分析。随后的串联质谱(MS/MS)鉴定出118种已知结构的化合物。初级和次级代谢物分为碳水化合物(11%)、氨基酸(23%)、脂肪酰(6%)、甘油磷脂(7%)、丙烯醇脂质(7%)、类黄酮(3%)、异黄酮(6%)和其他化合物。

首先根据无监督的多变量统计(PCA)检查代谢组学表型。得分散点图显示了群山Gunsan,麟蹄Inje和大邱Daegu地区的轮廓的明显区分,而其他地区则被分离(图S3B)。类似地,HCA根据区域详细说明了代谢物轮廓的相对距离(图2A)。坡州Paju区和报恩Boeun区的大豆代谢产物表现出最密切的连锁关系,其次是咸阳HamYang和康津Gangjin,以及麟蹄Inje和大邱Daegu地区之间的相似性。来自群山Gunsan的大豆显示出最独特的图谱,与多变量统计分析一致。此外,载荷散点图分析表明与每个区域高度相关的代谢产物(图S4)。

随后的OPLS-DA构建了具有良好适应度(R2Y=0.946)和可预测性(Q2=0.778)的监督模型。在该模型的基础上,根据VIP评分对5种代谢物进行排序,并将其转化为一个奇异向量,检验代谢物特征是否能区分所有7个区域的大豆。用ROC分析评价了该集作为生物标记簇的可预测性。AUC值在0.870~1.0(95%可信区间0.653~1.0)范围内均显著高于对照组(2C)。需要注意的是,与5种内源化合物重组的奇异值允许同时区分所有7种大豆的地理来源。代谢物清单包括色氨酸,这是次级代谢物生产的关键前体。其他的是丙二酰基异黄酮(丙二酰染料木苷和丙二酰大豆苷)和含氮化合物(N-乙酰鸟氨酸和醛赖氨酸)。与糖苷(大豆苷、黄豆黄苷和染料木素)相比,丙二酰基具有更高的不良口感。丙二酰基异黄酮是大豆食品中丰富的营养成分,具有潜在的药用活性。关于这些化合物的详细资料载于补充表1


2不同栽培区域特异性的综合代谢表型

注:(A)对7个不同地区种植的210种代谢物进行了层次聚类分析。(B)采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)(R2Y=0.946Q2=0.778)绘制分数散点图。(C)曲线下的面积(AUCs)和95%的置信区间,按ROC曲线分析,基于五种代谢物,按变量投影重要度(VIP)排序。

3.3大豆初级和次级代谢产物中反映的区域特异性独特性和共性

应用Metaboanalyst分析中的模式搜索模块,对栽培区特有的代谢产物进行了查询。统计结果表明,代谢物与栽培区之间存在着独特的相关性,与其他地区相比,这些代谢物可以转化为相对丰度。载荷散点图分析(图S4)直观地显示,大邱Daegu种植的大豆与次级代谢物含量的正相关程度最高,而群山Gunsan种植的大豆与初级代谢物的相关程度最高(图3AB)。代谢特征一般与总黄酮含量和抗氧化活性相对应(1)。此外,化学富集分析提供了基于化学相似性和本体映射的统计标准的综合分类(图3CD)。大豆异黄酮是大邱地区的次生代谢产物,与其他地区相比,大邱Daegu的次生代谢物含量最高,氨基酸含量显著降低。与此形成鲜明对比的是,在群山Gunsan地区,含有仲胺和丁酸盐的氨基酸特别丰富。


3栽培区特异性代谢物的鉴定

注:在Metaboanalyst中用模式搜索算法计算出与群山GunsanA)和大邱DaeguB)强相关的前25位代谢物列表。粉红色和蓝色分别表示正相关系数和负相关系数。群山GunsanC)和大邱DaeguD)中210种化合物的化学相似富集分析。X轴给出了代谢物簇的分配系数(XlogP)Y轴通过Kolmogorov-Smirnov检验表明了具有统计学意义的水平。每个簇中的节是根据增加或减少的化合物(红色=增加,蓝色=减少,粉红色=混合)的比例来着色的。用ChemRICH进行了绘图和计算。

3.3.1群山Gunsan地区

根据多元统计(PCAOPLS-DA,图S2B2BHCA,图2A)确定,群山Gunsan大豆在所有区域中显示出最独特的代谢特征。特别是,各种氨基酸含量的富集是该省的特征(谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸和脯氨酸)(图3A)。值得注意的是,脯氨酸衍生物,水苏碱的丰度是其他区域的18倍,具有较高的区域特异性(t=9.0)。糖醇和糖衍生物在该地区的含量较高(甘油酸、甘油、海藻糖、赤藻糖醇和赖西托)(3A)

3.3.2大邱Daegu地区

与其它区域相比,大邱Daegu区的大豆具有显著更高的次级代谢产物(类黄酮和异黄酮类)的含量。黄酮类化合物分为黄酮苷(芦丁和芹菜苷)和黄酮(山奈酚)。山奈酚,一种富含多种植物和植物源性食品的黄酮醇,在该地区的含量是其他地区的1.9倍。芦丁(黄酮-3-O-)和芹菜素(黄酮-7-O-)含量分别是其他6个地区的1.9倍和4.4倍。大邱富含的异黄酮包括1个异黄酮和5个异黄酮O-糖苷。黄酮类化合物含量较高,抗氧化活性显著提高(1)。其它特征化合物是磷脂、溶血卵磷脂和溶血磷脂的溶血形式(3B)

3.3.3麟蹄Inje地区

麟蹄Inje的大豆与大邱的大豆具有相对可比性,大邱与韩国东部省份具有相同的地理位置。HCA计算的热图确定了这两个区域与其他区域不同的共生代谢产物。在这两个地区,染料木素和大豆苷的乙酰形态都很丰富,而在大邱地区,则只有较高含量的染料木素和大豆苷元含量较高。同样,溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺在这两个地区都是共同丰富的(黄色框,图2A)。在其他次级代谢物中,黄酮类、圣草酚和柚皮素含量较高,特别是在Inje地区(分别是其他区域的1.5倍和1.4)。大豆皂甙(βa)和糖醇(松糖醇、梨糖醇、肌醇和半乳糖醇)含量高,是麟蹄Inje地区大豆特有的。大豆皂甙γaInje区的特异性最强(t=6.4)

3.3.4报恩Boeun和坡州Paju地区

与其他6个地区相比,报恩Boeun大豆的初级代谢产物含量相对较低。在报恩Boeun区,甘油磷脂、饱和脂肪酸和碳水化合物的中间产物含量相对较低。它包括乙醇胺、胆碱、LysoPC 181、棕榈酸、七烷酸、硬脂酸、葡萄糖、果糖和木糖。相反,报恩Boeun地区5种化合物(L-精氨酸、精氨酸、腺苷3’-单磷酸、3-吲哚丙烯酸和焦磷酸)含量相对较高。Paju大豆的代谢谱与Boeun区的代谢谱相似程度最高(2AB)Paju大豆的代谢唯一性最好由生物标志物簇的成分AllysineN乙酰annithyt>4.0)中的富集含量决定。生物标志物簇合物烯丙基赖氨酸和N-乙酰鸟氨酸的含量(T>4.0)是测定坡州Paju大豆代谢唯一性的最佳指标。氨基酸(β-丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和高L-精氨酸)具有中等水平的正连锁和区域特异性(t<4.0)。同样地,在次级代谢物中,丙二酰甘氨酸、大豆皂甙αg和大豆皂甙Bd在坡州Paju区域表现出正相关性。

3.3.5康津Gangjin和咸阳Hamyang地区

大豆代谢物分布在康津Gangjin和汉阳Hamyang地区最具可比性(图2AB),两者都位于韩国南部省份。在康津Gangjin大豆中,共有32种化合物呈显著正相关(p<.05),其中13种代谢产物含量较高(t>4.0)。在PLsTCA循环中间体(苹果酸和富马酸)和含N化合物(泛酸和哌啶酸)lyso形式中,区域特异性最高。这一地区醛类和二肽含量显著高于其它地区,而槲皮素、圣草酚、丙二酰黄豆苷和丙二酰染料木苷含量相对较低。咸阳Hamyang大豆的性状表现为正相关和负关联的最低水平。前25种候选代谢物中只有7个化合物显著相关。其中有3种代谢产物存在于相对较高的水平(眼酸、蜜二糖和胍丁胺)。

3.4.大豆代谢特异性可能相关地理性状的探讨

为了替代可能与独特代谢产物图谱相关的合理因素,我们分析了地理和气候数据(20155月至11月)。数据包括纬度、经度、平均温度和总雨量(图S2AC)。其中,群山Gunsan和大邱Daegu地区的总降雨量与其他地区相比,特别是在8月,呈现出明显的月降水模式(S2A)。大邱Daegu地区在栽培期间,特别是5月至7月的平均温度最高,而群山Gunsan和康津Gangjin地区的平均温度在8月至11月高于其他地区(图S2C)。对土壤质地进行了进一步的研究,一般分为狭缝壤土、砂壤土和外来土。群山Gunsan地区土壤质地类型主要为粉砂壤土(S2E)。相反,大邱Daegu、麟蹄Inje和咸阳HamYang地区(东海岸)被划分为砂壤土,而坡州Paju、报恩Boeun和康津Gangjin地区(西海岸)则具有借土特征。

4总结

本研究的主要目标是:1)建立大豆代谢产物的多重质谱分析方法,2)根据大豆的栽培区域特异性,为提出大豆代谢的唯一性提供概念证明,可用于农产品种植原产地的判别。本研究在GC-MSLC-MS的基础上,获得了实际种植在区域性商业农场的大豆样品的综合代谢谱,并由国家农产品质量管理局收集用于鉴别种植来源。综上所述,多变量统计模型与相关模式搜索相结合,确定了栽培区特有的代谢特征。随后对地理特征与区域特定代谢特征的结合进行了探讨,提出了假设的关联性,该关联性可推广应用于韩国农产品国内种植原产地的真实确定。