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文献解读

集思慧远客户发表《整合蛋白质组和转录组数据揭示了酿酒酵母对禾谷镰刀菌的控制机制》

发布日期:2019-07-04 浏览次数:62


合作单位:江苏大学食品与生物工程学院

摘要

背景:据报道,拮抗微生物能有效地控制禾谷镰刀菌的侵染。然而,有关酿酒酵母对禾谷镰刀菌的控制作用的信息有限,同时通过蛋白质组学和转录技术研究其可能的调控机制。

结果:我们的研究结果如下所示,酿酒酵母Y-912对禾谷镰刀菌Fg1的生长有明显的抑制作用,酿酒酵母Y-912也显著抑制了禾谷镰刀菌Fg1的孢子萌发率和胚管长度。蛋白质组学分析表明,差异表达的蛋白质是由一些与基础代谢有关的基本蛋白质和酶组成的,如甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、磷酸甘油酸变位酶(PGAM)、烯醇化酶(ENO)、果糖二磷酸醛缩酶(FBA)等,这些都下调表达。分析了酿酒酵母(S.cerevisiae)对禾谷镰刀菌(F.graminearum)的转录调控。

结论:酿酒酵母Y-912对禾谷镰刀菌Fg1的控制机制是一种非常复杂的物质和能量代谢过程,其中涉及糖酵解途径,TCA循环和氨基酸代谢的相关蛋白质和基因全部下调。

引言

赤霉病(FHB),也称为小麦赤霉病,是世界上广泛和经济上毁灭性的疾病,由禾谷镰刀菌、念珠菌和其他镰刀属引起小麦产量损失和品质下降。禾谷镰刀菌(F.graminearumis)1902年首次发现的小麦赤霉病(FHB)的致病因子,并被证明能产生玉米烯酮(一种由粉红镰刀菌产生的霉菌毒素)(ZEN)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)等真菌毒素。小麦籽粒中ZEN的发生引起了研究者的广泛关注。ZEN是一种三叶草烯霉毒素,存在于许多粮食作物,特别是小麦、玉米和谷类作物中,可引起人和动物,如猪、牛和小鼠的生殖问题。为了保障消费者的安全,食品和农业组织(粮农组织)将ZEN的临时最大容许日摄入量(pMTDI)设定为体重的0.5μgkg-1

已经开发了许多方法,例如培育抗病小麦植物,物理净化剂使用,合理的杀真菌剂,及时收获和低水分含量,以减少霉菌毒素的毒性。目前,使用的一些物理和化学方法是成功的,但它们也有缺点和有限的效果。传统的物理方法控制毒素污染存在成本高、时间和资源浪费等缺点。据报道,过量使用化学杀菌剂会对粮食安全和环境造成很大的危害和污染。利用有益微生物或微生物代谢物控制作物病害是一种生物防治策略。有一些成功的例子使用微生物生物防治剂来控制植物病原体的生长和繁殖。用于生物防治的微生物主要是从生态系统中的植物和土壤中分离出来的菌株,包括细菌、真菌和少量具有拮抗作用的放线菌。

本文通过蛋白质组学和转录组技术研究了酿酒酵母Y-912对禾谷镰刀菌Fg1的防治效果以及酿酒酵母Y-912对禾谷镰刀菌Fg1生长的控制机制。

材料与方法

病原体

从侵染小麦中分离得到到禾谷镰刀菌Fg1。在马铃薯葡萄糖琼脂培养基4℃下培养。在随后的实验中,在25℃的豆汤培养基上生长禾谷镰刀菌Fg1。在无菌蒸馏水中,用血细胞计将禾谷镰刀菌Fg1浓度调节为1×105cell/mL

酵母菌

从葡萄中分离得到酿酒酵母Y-912,并在实验室进行了鉴定。在营养酵母葡萄糖琼脂培养基4℃下培养

不同浓度酿酒酵母Y-912对禾谷镰刀菌Fg1菌丝生长的影响

用无菌冲头将直径约5mm的孔制成PDA培养基(30mL)100μL的酿酒酵母Y-912悬浮液(浓度为1×107cell/mL1×108cell/mL1×109cell/mL5×109cell/mL)加入孔内,以无菌水为对照。2h后,将100μL禾谷镰刀菌Fg1孢子悬浮液(1×105cell/mL)加入孔中。培养皿用塑料包裹密封,然后放置在培养箱中。在温度和湿度分别为25℃95%的条件下用游标测径仪测定了禾谷镰刀菌Fg1菌丝的长度。重复两次实验,每一次实验有三个重复。

不同浓度酿酒酵母Y-912对禾谷镰刀菌Fg1孢子萌发率和胚管长度的影响

在马铃薯-葡萄糖肉汤(PDB)和不含琼脂的PDA培养基上,测定了酿酒酵母Y-912对禾谷镰刀菌Fg1孢子萌发率和胚芽管长度的影响。制备100ml20mlPDB培养基的锥形瓶,用1ml酿酒酵母Y-912悬浮液(浓度为1×107cell/mL1×108cell/mL1×109cell/mL5×109cell/mL)处理,并以1mL无菌蒸馏水作为对照。在每瓶中分别加入1mL禾谷镰刀菌Fg1悬浮液,将禾谷镰刀菌Fg1调至1×105cell/mL的终浓度。将烧瓶在120rpm25℃下孵育15h。通过显微镜观察大约100个孢子以确定禾谷镰刀菌Fg1的发芽率,并通过显微镜法测量禾谷镰刀菌Fg1的胚芽管长度。将实验重复两次,每次处理重复三次。

蛋白组分析

样品处理:将未添加酿酒酵母Y-912PDB培养基中培养4d(禾谷镰刀菌Fg1培养2d,然后加入1mL无菌蒸馏水并进一步培养2d)的禾谷镰刀菌Fg1作为对照。

样品量要求:1×109cell/mL

检测平台:2-DE凝胶电泳;MALDI TOF/TOF质谱仪;

分析软件:MASCOT软件;

转录组分析

样品量要求:0.1g

测序平台:Illumina Hiseq2500

分析内容:基因注释、基因表达量;

RT-qPCR

选取6个基因做表达量水平验证;

结果

酿酒酵母Y-912对禾谷镰刀菌Fg1PDA培养基中菌丝生长的影响

从图1可以看出,与对照相比,当在禾谷镰刀菌Fg1培养基中加入不同浓度的酿酒酵母Y-912时,禾谷镰刀菌Fg1菌丝的延伸长度显著降低。随着酿酒酵母Y-912浓度的增加,禾谷镰刀菌Fg1菌丝的长度减少。当酿酒酵母Y-912浓度为1×109cell/mL时,禾谷镰刀菌Fg1的长度为49.51mm。结果表明当酿酒酵母Y-912浓度为5×109cell/mL对禾谷镰刀菌Fg1菌丝的控制效果最为明显,长度仅为43.99mm

Fig. 1 Effects of various concentration of S. cerevisiae Y-912 on mycelial extension of F.graminearum Fg1.

1 不同浓度酿酒酵母Y-912对禾谷镰刀菌Fg1菌丝生长的影响

酿酒酵母Y-912对禾谷镰刀菌Fg1孢子萌发率和胚管长度的影响

从图2中可以看出,与对照相比,添加酿酒酵母Y-912后,禾谷镰刀菌Fg1孢子萌发率和胚芽管长度均显著降低。随着酿酒酵母Y-912浓度的增加,禾谷镰刀菌Fg1孢子萌发率下降。酿酒酵母Y-912浓度为1×109cell/mL禾谷镰刀菌Fg1的孢子萌发率只有1.93%明显低于对照组(96.58%)。当酿酒酵母Y-912浓度为5×109cell/mL时,能完全抑制禾谷镰刀菌Fg1孢子的萌发。

随着酿酒酵母Y-912浓度的增加,禾谷镰刀菌Fg1的胚管长度降低。当浓度为1×109cell/mL时,禾谷镰刀菌Fg1的平均生殖管长度仅为11.63μm,低于对照组(57.17%)。当酿酒酵母Y-912浓度为5×109cell/mL时,禾谷镰刀菌Fg1的平均生殖管长度仅为7.78μm,而对照组为71.35%

Fig. 2 Effects of S. cerevisiae Y-912 on spore germination rate (A) and germ tube length (B) of F. graminearum Fg1.

2酿酒酵母Y-912禾谷镰刀菌Fg1孢子萌发率(A)和胚管长度(B)的影响

禾谷镰刀菌Fg1中差异表达蛋白的鉴定

析了由酿酒酵母Y-912控制的禾谷镰刀菌Fg1和禾谷镰刀菌Fg1的全蛋白表达情况。在每个凝胶中检测到160个差异表达的蛋白质(平均fold change1.5)80个显著差异表达蛋白质(平均fold change2)。在80蛋白质中,46蛋白质被显著上调,34蛋白质被显著下调。然而用质谱(MS)鉴定40个显著差异表达的蛋白质。这些蛋白质的详细信息列于表1

Fig. 3 Proteome analysis of the F. graminearum Fg1 (A) and F. graminearum Fg1 controlled by S. cerevisiae Y-912 (B).

3蛋白质组分析

48个差异蛋白点的基本信息进行了分类,包括分子量、等电点和肽匹配。从表1中可以看出,大多数蛋白质与细胞的基础代谢有关,而有些则是在氧化应激下产生的应激蛋白。结果表明,禾谷镰刀菌Fg1中的差异表达蛋白是与基础代谢相关的酶,包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、糖酵解途径中的烯醇化酶(ENO)(PGAM)果糖二磷酸醛缩酶(FBA)和苹果酸脱氢酶(MMD)的柠檬酸途径,以及一些与能量代谢和氨基酸代谢有关的酶,由酿酒酵母Y-912控制的禾谷镰刀菌Fg1中的这些酶显著下调。

Table 1 MS/MS analysis identification of differentially expressed proteins in F.graminearum Fg1 and F. graminearum Fg1 controlled by S. cerevisiae Y-912

1差异表达蛋白质列表(部分)

禾谷镰刀菌Fg1基因的转录及功能分析

RNA-Seq技术分析了由酿酒酵母Y-912控制的禾谷镰刀菌Fg1和禾谷镰刀菌Fg1的转录水平。共检测到4132(|log2(Fold Change)|>1)DEGs(差异表达基因),其中3318个基因表达上调,814个基因下调。另外,229个基因显著增加,20个基因显著下调(|log2(Fold Change)|>2)。这些DEGs按基因功能与基因本体(GO)聚类(5)。生物过程包含14个亚,分子功能包含16个亚。最具活力的GO类别是对生物刺激和防御反应的应。属于生物学过程范畴的非生物胁迫基因是酿酒酵母Y-912诱导抗性的重要基因。

Fig. 4 GO categorization of differentially expressed proteins in F. graminearum Fg1 and F. graminearum Fg1 controlled by S. cerevisiae Y-912.

4差异表达蛋白的GO分类

Fig. 5 GO enrichment analysis of the differentially expressed genes from F.graminearum Fg1 and F. graminearum Fg1 controlled by S. cerevisiae Y-912.

5差异表达基因的GO富集分析

酿酒酵母Y-912控制的禾谷镰刀菌Fg1相关基因的相对表达水平

为了验证这些感兴趣的基因在禾谷镰刀菌Fg1中表达水平的差异,采用RT-qPCR分析了与ZEN合成相关的6个基因的mRNA水平。从图6可以看出,FG05_10207(脂肪酸基-CoA脱氢酶)FG05_07693(葡萄糖-6-磷酸异构酶)FGSG_04543(葡糖胺-6-磷酸-N-转移酶)FGSG_10783(内切几丁质酶)FGSG_02352(柠檬酸合成酶)的表达水平均显著降低。5种基因的表达水平均显著降低,分别为对照组的0.65倍、0.7倍、0.4倍、0.5倍和0.5倍。此外,与对照组相比,FGSG_08608(应答调节蛋白)的表达水平显著上调1.5倍。这些基因表达水平的变化趋势与转录组分析结果一致。

Fig. 6 RT-qPCR validation of the differentially expressed genes.

6 RT-qPCR对差异表达基因的验证

总结

从总体上看,酿酒酵母Y-912对禾谷镰刀菌Fg1的控制机制是一个非常复杂的物质和能量代谢过程,从蛋白质组学和转录组学的角度来看,由酿酒酵母Y-912控制的禾谷镰刀菌Fg1的过程参与了糖酵解途径、TCA循环和氨基酸代谢。微生物的糖酵解是一种常见的代谢途径,用于碳水化合物转运、代谢、催化活性、生长和发育,同时为其他代谢产物提供中间体。另一个重要的代谢桥梁是柠檬酸循环,也称为TCA,这不仅是丙酮酸氧化的通道,也是脂肪酸、氨基酸等燃料分子氧化分解的常见途径。氨基酸是多种重要的生物氮化合物前体,在正常代谢过程中可转化为丙酮酸,草酰乙酸,α-酮戊二酸和其他代谢中间体。

然而,该实验中存在大量蛋白质功能,无法鉴定,也未与禾谷镰刀菌Fg1的代谢直接相关,ZEN合成的代谢途径需要进行更深入的分析和探索。为了进一步探索酿酒酵母Y-912对禾谷镰刀菌Fg1的控制机制中的关键蛋白和关键调控基因,还需要做大量的工作。


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