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文献解读

集思慧远客户发表《耶氏解脂酵母Y-2对赭曲霉毒素A降解反应的蛋白质和转录组分析》

发布日期:2019-06-28 浏览次数:247

合作单位:江苏大学食品与生物工程学院

发表期刊:Annals of Applied Biology

影响因子:IF=2.046

研究背景

      在谷物、饲料和食品中,曾报道过ochratoxin A(OTA)的发生。OTA的生物防治被认为是一种很有前途的策略。先前研究表明耶氏解脂酵母Y-2可降解OTA。本研究采用蛋白质组学和转录组分析的方法,研究了耶氏解脂酵母Y-2降解OTA的可能机制及其拮抗酵母的反应。结果表明:耶氏解脂酵母Y-2中参与去除活性O2有关的蛋白质和基因进行了上调,以响应OTA引起的氧化应激。此外,在应激条件下除去产生的毒物所涉及的一些蛋白质和基因被上调,以改善这种拮抗酵母对OTA压力的耐受性。此外,一些编码转运蛋白和多药耐药蛋白的基因被显著上调,从而从细胞中转运和排出OTA,减轻对耶氏解脂酵母Y-2的毒性。值得注意的是,直接参与OTA降解的ECM14基因(编码金属羧肽酶ECM14)在该真菌毒素处理的Y-2中表达上调。为了抵御OTA胁迫,OTA诱导了一些与三羧酸循环相关的基因,为耶氏解脂酵母Y-2产生丰富的能量。此外,参与DNA复制和修复的一些基因的下调也降低了耶氏解脂酵母Y-2修复OTA所致DNA损伤的能力。这些结果可能意味着这种拮抗酵母的OTA降解是多种防御反应对OTA应力的协同作用。

材料与方法

蛋白组分析

样品用量:1×108cell/mL;

检测平台:2D凝胶电泳;基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS);

差异蛋白筛选:fold change≥1.5 or ≤0.67且p<0.05;

转录组分析

测序平台:Illumina Hiseq 2500 PE150;

差异基因筛选:log2 fold change >1 (FDR < 0.05)且p<0.05;

分析内容:差异基因GO功能注释及KEGGs功能注释;

RT-qPCR分析

选取16个基因进行表达量水平的验证;


主要研究结果

01 蛋白组分析

      用2-DE分离的OTA或不经OTA处理的耶氏解脂酵母Y-2的所有蛋白质如图1a,b所示。忽略非常微弱的斑点和不确定形状和区域的斑点,在每个凝胶中共检测到512个蛋白质点,其中77个DEPs(平均fold change≥1.5或≤0.67,p<0.05)。此外,通过MALDI-TOF/MS鉴定66个DEPs,包括43个上调的蛋白和23个下调蛋白。

图1不含(A)和含1μg/mL OTA(B)处理的耶氏解脂酵母Y-2蛋白的2D凝胶电泳

图2差异蛋白的功能分类

02 转录组分析

      用RNA-Seq分析了经OTA处理或不加OTA处理的Y-2的转录组分,并将其存入GEO数据库,登录号为GSE123081。总共获得了这两种处理的27,033,428和22,439,334个clean data,并对OTA处理的耶氏解脂酵母Y-2和不经OTA处理的耶氏解脂酵母Y-2的基因表达水平进行了比较。结果表明,1,156个基因表达差异,其中691个基因表达上调(log2Y+OTA/Y>1,FDR<0.05),465个基因表达下调(log2Y+OTA/Y<−1,FDR<0.05)(图3)。在经OTA处理的耶氏解脂酵母Y-2中,250个基因明显上调(log2Y+OTA/Y>2,FDR<0.05),211条基因显著下调(log2Y+OTA/Y<−2,FDR<0.05)。

图3不含和含1μg/mL OTA处理的耶氏解脂酵母Y-2的差异表达基因


图4差异表达基因的GO富集分析



图5差异表达基因的KEGG富集分析

03 RT-qPCR分析

        从转录组分析结果来看,参与耶氏解脂酵母Y-2对OTA反应的基因包括AN5440,CCP1,yakc,AflN,gto2,MFS,CDR1,sdh1,sdh3,acob,icdA,ECM14,SGS1,pol3和rad15,为了验证这些基因的表达水平,使用了表1所示的引物。RT-qPCR结果显示OTA处理后耶氏解脂酵母Y-2的AN5440(图6a)、CCP1(图6b)、yakc(图6c)、AflN(图6d)、gto2(图6e)、MFS(图6f)、CDR1(图6g)、sdh1(图6h)、sdh3(图6i)、acob(图6J)、icdA(图6k)和ECM14(图6l)的相对表达水平均增加。此外,耶氏解脂酵母Y-2的SGS1(图6m)、pol3(图6n)和rad15(图6o)被OTA下调。RT-qPCR的表达结果与转录组数据一致。

图6用RT-qPCR方法验证了耶氏解脂酵母Y-2对OTA的反应中不同表达的基因(部分)


总结

      蛋白质组和转录组分析的结果表明,耶氏解脂酵母Y-2的防御系统被激活,以响应OTA引起的氧化应激,在应激条件下,一些参与清除产生的毒物的蛋白质和基因也被上调。此外,编码转运蛋白的相关基因被上调,从细胞中转运和排出OTA,从而减轻了耶氏解脂酵母对Y-2的毒性。同时,直接参与OTA降解的基因ECM14在该真菌毒素处理的耶氏解脂酵母Y-2中表达上调。为了防御OTA胁迫,一些蛋白质和编码在TCA循环中起重要作用的酶的基因被上调以产生解脂耶氏酵母Y-2的充足能量。此外,参与DNA复制和修复的基因的下调也降低了耶氏解脂酵母Y-2修复OTA所致DNA损伤的能力。这些结果表明,该拮抗酵母对OTA的降解可能是对OTA胁迫的多种防御反应的协同效应。本研究有助于了解耶氏解脂酵母Y-2降解OTA的分子机制以及该拮抗酵母对OTA的响应。


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