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常见问题汇总(蛋白组学篇)

发布日期:2019-03-08 浏览次数:233

蛋白质组学是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域。



Q:什么样的样本可以做蛋白定性分析?

A:蛋白质溶液、SDS-PAGE条带(考染、银染条带清晰可见)、Western blot目标条带、双向凝胶电泳点等样本,符合送样要求均可进行蛋白质定性,就样本不同定性出来的蛋白质数量会有差别。


Q:蛋白全谱分析能鉴定多少蛋白?

A:蛋白全谱分析鉴定的蛋白数与物种、样本中蛋白质含量及复杂程度、蛋白组分分离程度、数据库的完整度都有很大的关系。一般情况下,一次全谱分析可以鉴定3000-5000种蛋白;但一般胶条可以鉴定几种到几百种蛋白质。


Q:双向凝胶电泳与质谱联用鉴定蛋白的过程是什么?

A:通过对蛋白质双向电泳的图谱扫描,进行谱图差异分析,找出差异点切出,进行脱色、酶解、质谱检测,得到质谱原始数据文件,通过数据库搜索可以得到差异点蛋白质的详细信息。


Q:目前可进行蛋白全谱分析的物种有哪些?

A:只要数据库中该物种或近缘物种的蛋白质组数据趋于完整,基因组序列或转录组数据已知,均可进行蛋白全谱分析。对于以上条件不满足的物种,可在蛋白质组全谱分析的同时,做一个基因组或转录组测序,以便为蛋白全谱分析提供支持。因此,理论上所有的物种均可进行蛋白全谱分析。


Q:iTRAQ定量蛋白质组和2-DGE相比,有什么优势?确实比2-DGE效果更好么?

A:2-DGE是伴随着MALDI-TOF技术发展起来的蛋白质分离技术,理论上可以通过蛋白质等电点(IEF)和分子量(SDS-PAGE)的差异将总蛋白质逐一分开,但实际情况并不理想,由于低丰度蛋白无法染色成功而导致看不见,蛋白翻译后修饰后偏离理论位置等等,一张2-DGE能鉴定到的蛋白质总数最多2000种蛋白。而iTRAQ是伴随LC-MS/MS技术发展起来的蛋白质组定量技术,不用做双向电泳,同时可以克服2-DGE无法鉴定低丰度和修饰蛋白干扰的情况,一针即可鉴定2000种左右的蛋白(1.5hr),分组上机后,依据不同物种的情况鉴定到的蛋白质数量也有差别。iTRAQ的优势不仅仅在于定量蛋白质组的数量,还在于单次实验可以同时做4~8个样本,降低仪器的系统误差,保持高通量定量能力。一般的定量蛋白质组实验,iTRAQ优势远远大约2-DGE,属于两个时代的技术。

Q:iTRAQ如何做9个样品的标记?

A:iTRAQ试剂盒分为4标和8标;4标试剂盒标签分子量分别为114,115,116,117;而8标试剂盒标签分子量分别为113,114,115,116,117,118,119,121。由于9个样品不能用8标的试剂盒同时标记,不建议用两种试剂盒分别标记,而且有重叠的标签,一般建议客户生物学重复2,3,3或者2,2,2。

Q:iTRAQ定量蛋白质组做完实验后,能拿到什么结果呢?可以直接用来发文章么?

A:我们目前的iTRAQ定量蛋白质组的实验流程和结果都是受到业内顶级杂志公认的,可以直接用于文章的发表。客户不仅可以拿到iTRAQ定量蛋白质组中的差异蛋白、蛋白的GO和COG/KOG功能分类信息、KEGG通路分析、不同样本的差异蛋白的聚类分析、差异蛋白的互作网络等等,还可以为客户提供指定的分析内容,提供个性化的服务要求,比如多组学联合分析:转录组和蛋白组,蛋白组和代谢组等等。

Q:关于“样品重复”,技术重复和上机重复有什么区别?发表的文章一般要求几次重复呢?

A:一般的文章会要求3个生物学重复,如果iTRAQ后续做了大量的WB或ELISA验证,那么,2个生物重复也是必要的;仅做1个生物重复有风险,因为如果是实验过程出现问题,缺乏结果的评估,往往说服力不够,对文章发表可能构成影响,建议客户最好不要只作1次重复,至少2次。

技术重复一般和上机重复非常类似,即上质谱的重复,即测试仪器的稳定性,判断系统误差等问题。这一说法主要和质谱仪器的发展进程相关,早期的仪器不是很稳定,同一个样本上机3次,结果差异较大,当前的上机重复仍然在一些JPR和MCP文章中可见,即沿用了早期的习惯。而应用型的文章中,上机重复或技术重复一般没有硬性规定,可以不做,如果做了当然最好,editor就不会再此处找你的问题。

Q:iTRAQ、SILAC和SWATH等相比,应该选择哪一种定量的方法呢?

A:目前主流的定量蛋白质组方法有5种,分别是iTRAQ、SILAC、label-free和SWATH。其中最流行的是iTRAQ定量蛋白质组方法,该方法不依赖样本,可以做任意样本的总蛋白质的差异定量,而且定量准确;label-free虽然也可以做任意样本的蛋白质定量,但是不能避免系统误差,定量准确度难以保障。SILAC是仅仅适用于标记活的可传代细胞、细菌等材料,不能标记组织、体液等样本,需要用稳定同位素进行体内标记,耗时较长。SWATH是数据非依赖型(DIA)的第二代蛋白质谱技术,和以数据依赖型(DDA)为基础的shot-gun法以及SRM法相比,最大的优势在于获得蛋白质数据的完整性和精确性,兼具shot-gun法的高通量以及SRM法的可重复性,但是成本非常高。DIA和DDA区别详细请见“常见问题汇总(代谢组学篇)”。

Q:不同客户的样本做iTRAQ定量可否放在一组上机?

A:有些老师比较了解iTRAQ定量蛋白质组的流程,因此,有此问题。我们的专业决定了我们坚决不会将不同客户的样本混合到一起上质谱。如果客户的样品来自不同物种,那么质谱鉴定的数据库选择会不同,无法进行比较。如果是同一个物种的样品,那么经过不同实验室处理后,样品里的蛋白含量和数目会有较大差别,混在一起后会影响两组不同来源的样品的蛋白鉴定数目。