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文献解读

集思慧远客户发表《花椒种子中抗菌肽的发现与鉴定》

发布日期:2019-04-24 浏览次数:294

合作单位:四川农业大学

发表期刊:Applied Microbiology and Biotechnology

影响因子:IF=3.34(SCI二区)

研究背景:抗菌肽AMPs是一种重要的宿主防御肽,可以防止天然免疫系统受到病原体的攻击。到目前为止,根据在线抗菌肽数据库(APD),已经从细菌、植物、动物和真菌等不同种类中发现了近2980个抗菌肽。AMPs的发现和表征是进一步研究其性质的关键。传统的筛选AMPs的方法通常涉及从复杂食物来源中提取、分离和纯化多肽,以及纯化成分的鉴定。然而,事实证明,这些过程是耗时、劳动密集型和低收益的。因此,有必要开发更有效的方法来发现AMPs。多肽是蛋白质组学的一个子领域,广泛应用于肽的识别和表征。

实验目的:开发一种新的方法,通过多肽组学和生物信息学的方法,从花椒种子中发现蛋白水解物。然后化学合成了潜在的AMPs,并对其抗菌活性进行了测试,并确定已证实的AMP的结构。这项研究为发现AMPs提供一种有效的途径,同时也证明花椒种子是获得AMPs的一种自然资源。

实验取材:利用花椒种子去油干燥后的粉末提取蛋白质,并利用胃蛋白酶获得蛋白水解物。

实验内容:多肽组学、抗菌肽合成、抗微生物试验等。

检测平台:UPLC-ESI-MS/MS(nanoACQUITY UPLC system-Q Exactive mass spectrometer )

主要研究结果

01多肽组学定性及定量分析

在本研究中,利用PEAKS软件对多肽进行了新的序列分析。然后,针对芸香科UniProt搜索光谱数据,共发现4358个肽,其中数据库确认序列3137个,新发现序列1221个。在这些多肽中,1436个序列被注释为70个已知蛋白质的组分,其中以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)为主,其次是蔗糖合成酶(蔗糖合成酶)。多肽的代表性谱图(NP-6),其序列被确定为AGDKKIKIGINGFGRIGRL,如图1所示。

图1 NP-6 MS/MS谱图

02潜在抗菌肽及抗菌性能

通过使用在线预测服务器,总共预计16种肽,称为NP-1至NP-16,是潜在的AMPs。表1和表2列出了潜在肽的理化性质和预测评分。如表1所示,所有这些肽的净电荷为2~4,长度为15~28,分子量为1.5-2.7kDa。表2表明不同的方法有自己的计算策略;预测结果可能彼此不同。例如,NP-2,NP-8和NP-10通过CAMP具有高预测分数,但是通过AntiBP2具有相对低的分数。

表1 nanoUPLCMS/MS法鉴定花椒种子蛋白水解产物的理化性质

表2使用三种基于web的服务器预测潜在抗菌肽的结果


化学合成16种潜在肽,然后通过RP-HPLC系统纯化,并通过ESI-MS技术表征。这些多肽进一步测试其对细菌和酵母的抗微生物活性。4个多肽NP-2、NP-5、NP-6和NP-7在检测浓度范围内显示出抑制作用(图2a)。MIC分析表明,NP-6来源于GADPH,富含甘氨酸,对所有供试菌株均有活性。但NP-2、NP-5和NP-7对这些菌株具有选择性抗菌活性(表3)。

此外,观察到多肽NP-7与NP-6共享基序GINGFGRIGRL,但它如何影响两种肽的活性尚不清楚。此外,NP-6对革兰氏阴性细菌更有效。考虑到NP-6的广谱活性,选择NP-6作为进一步的实验对象。


图2 NP-6的抗菌性能

注:a NP-6对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长抑制。b用2×MIC NP-6处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的时效曲线。

表3预测AMPs的抗菌活性


03扫描电镜分析结果

通过SEM评估NP-6对细菌细胞形态的影响。如图3所示,与NP-6一起培养的大肠杆菌细胞在表面上显示出坑洼(图3c,d),用NP-6处理的金黄色葡萄球菌细胞在表面上具有更多的碎片并且在细胞的中心凹陷(图3g,h)。

图3大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的扫描电镜

注:大肠杆菌的SEM显微照片:a,b对照;c用NP-6处理。金黄色葡萄球菌的SEM显微照片:e,f对照;g,h用NP-6处理。中间对数生长的细菌用NP-6以1×MIC处理2h。

04NP-6结构分析

在通过仪器评估结构之前,将NP-6的序列提交给I-TASSER,I-TASSER是蛋白质结构和功能预测的分级方法。预测的NP-6三维模型如图4a所示。这表明NP-6大部分由无规卷曲和小部分的α-螺旋组成。为了评估NP-6在不同溶剂中的构象,使用CD分光光度法。如图4B所示,NP-6的光谱是ddH2O中的无序构象,其在200nm附近显示负的最大值。相比之下,它在50%TFE存在下采用α-helix构型,分别从208和220nm处的两个负最大值推断。

图4 NP-6结构分析

注:a NP-6的预测三维模型。b NP-6在不同溶剂中的CD光谱。

点击原文链接:http://doi.org/10.1007/s00253-018-09593-y查看论文全文。