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文献解读

集思慧远客户发表文章《联合转录组学和蛋白组学数据分析揭示了赭曲霉毒素A在青霉素中通过pH调控生物合成》

发布日期:2019-03-20 浏览次数:204


  合作单位:江苏大学  

  发表杂志:RSC Advances  

  影响因子:3.108

  

  研究背景  

  赭曲霉毒素A(OTA)由于侵染了曲霉属和青霉属的丝状物种而在各种植物和动物中被发现,OTA被国际癌症研究机构(IARC,1993)归类为人类潜在致癌物(2B组),其呈现肾毒性,肝毒性,神经毒性,致畸性和免疫毒性;因此,它对人类和动物具有潜在危害。OTA是一种常见的霉菌毒素,包括谷物,葡萄,咖啡,坚果,香料,可可豆以及通过这些物质加工而成的各种食品及其制品。葡萄及其衍生物是继谷物之后受OTA毒害最严重的物种。OTA在地方性肾病病因学中的作用及其与泌尿道肿瘤的关系也得到了证实。OTA由细胞色素P450酶和过氧化物酶酶活性引发的自由基形成苯醌亲电体。OTA由于其稳定性高而对人体特别有毒。基于OTA的强毒性和致病性,一些组织机构已经规定了食品中OTA含量的最高水平和指导方针。

  产生OTA的菌株主要包括青霉属和曲霉属,少数石座菌属和枝孢菌属菌株。OTA生成速率受底物污染物种类,环境条件和地理区域的影响。在温带气候条件下,OTA主要由青霉属产生,而热带和亚热带地区则由曲霉菌种产生。

  

 材料与方法

  从被感染的葡萄中分离出桔青霉菌X9-4,菌种在不同pH条件下培养两周后获得菌丝体和孢子,并进行蛋白质和RNA提取。OTA测定:Agilent ZORBAX SB-C18反相高效液相色谱。

  

  蛋白质组学

  分离:等电聚焦和二维凝胶电泳  

  检测平台:HPLC-ESI-TOF-MS/MS  

  基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)

  转录组测序

  检测平台:illumina Hiseq2500  

  反转录和实时定量PCR

  反转录试剂盒:Thermo Scientific

  实时荧光定量:SYBR Premix Ex Taq™ (Tli RNaseH Plus)(TaKaRa, Dalian, China);ABI StepOnePlus Real-Time PCR Systems(Applied Biosystems, CA, USA)

  

  结果与讨论

  1. pH对菌株X9-4的生长和OTA产生的影响

  

  

  图1 不同pH值下桔青霉菌的菌落直径和OTA产量

  

  菌株生长的pH范围较宽,但碱性环境不适合其生长。在pH值为11时,菌落直径为12 mm,是pH值为7的培养基的一半,其中pH7是菌落生长最有利的pH值。相比之下,当培养基的pH在3和9之间时,菌落直径非常接近。关于pH对菌株产生毒素的影响,在pH5和9的培养基中毒素产生率较高,并且在pH5时毒素的最高浓度为25.6ng g-1。另外还观察到当菌株在pH 3下培养时,没有检测到OTA;这表明其在酸性环境中的生物合成被抑制。

  

 2. 参与生物合成的蛋白质在不同pH条件下的相对表达

  

  为了研究酸性环境如何抑制OTA生物合成的机制,提取了pH 3和5培养的桔青霉菌的总蛋白质。如图2所示,使用PDQuest在每个凝胶上总共检测到300个蛋白质,其中90个为差异表达蛋白质,并且通过MALDI-TOF / TOFMS鉴定25个最佳分辨的斑点(表1)。

  

  

  图2 在不同pH值培养的桔青霉菌总蛋白质的二维图谱

  

  表1 MS / MS分析鉴定的pH 3和pH 5下培养的桔青霉菌不同表达的蛋白质

  

  

  3.差异表达蛋白分析

  

  

  图3 不同表达蛋白斑点的功能分类

  

  桔青霉菌桔合成OTA可能与基础代谢相关(图3)。当桔青霉菌在pH5下培养时,代谢和合成相关蛋白上调表达,如:果糖-二磷酸醛缩酶(FBA,斑点11和4)和核苷-二磷酸-糖差向异构酶。当桔青霉菌在pH5下培养时,转醛醇酶(斑点14)下调表达。因此转醛醇酶的下调表达可以减少桔青霉菌中OTA合成所必需的丙酮。

  

  能量对于OTA的生物合成至关重要,PP途径是提供NADPH的重要来源。当菌株在pH 5下培养时,6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH,斑点25)的表达降低。也就是说,当菌株在pH 3下培养时,PP途径更具活性。转酮醇酶(斑点21)是磷酸戊糖循环中的重要酶,并且减少磷酸焦磷酸酯周期,以焦磷酸硫胺素和镁离子作为酶活动基。磷酸丙糖异构酶(斑点10)催化丙糖磷酸酯异构体在磷酸二羟丙酯和D型甘油醛3-磷酸之间转化,在糖酵解过程和能量供应中有至关重要的作用。然而,在pH 5条件下,磷酸丙糖异构酶的表达下降。腺苷酸激酶(斑点19)是能量代谢中重要的酶,其催化三磷酸腺苷(ATP)导致腺苷单磷酸(AMP)和二磷酸腺苷(ADP) 磷酸化。在pH5培养时,涉及能量代谢的两种蛋白质上调表达:磷酸丙酮酸水合酶和氨基酸转运蛋白ATP结合亚基。通过糖酵解甘油酸(PGA) -烯醇磷酸酯型丙酮酸(PEP)的不良反应将PEP转化为PGA,参与糖异生过程中的磷酸蝶呤水合酶(斑点24),在细胞能量代谢过程中发挥重要作用。磷酸腺苷蛋白亚基(斑点18)参与生物能量的生成过程,二肽磷酸腺苷参与合成dTDP-4-乙酰胺基-α-D-海藻糖(dTDP-N-乙酰异氨基苯甲胺)。在酸性条件下,一部分参与能量代谢的蛋白质上调表达,其他蛋白质在菌株X9-4中下调表达。

  

  6PGDH(斑点25)在PP途径中的代谢过程中产生一种称为NADPH的物质,可以保护细胞免于氧化。因此,6PGDH参与能量代谢并引起压力。醛脱氢酶(斑点23)在提高生物体抗性方面起重要作用。有研究表明在低温胁迫下,遗传修饰(SoBADH基因)菌株表现出较高的醛脱氢酶活性,并且显著改善抗冻性能。还有差异表达的蛋白质,如70 kDa热激蛋白(斑点3)与免疫反应相关。

  

  产生的毒素需要通过载体排出。在pH 5的培养条件下,谷胱甘肽S-转移酶39(GSTs,斑点8)表达上调。GST是广泛分布于各种生物体中的一组多功能同功酶,其功能包括与巯基还原型谷胱甘肽物质的亲电基团的偶联;这使得它通过增加其物质疏水性而更容易穿过细胞膜。据观察,GSTs上调表达的酶和OTA生产效率呈正相关,当GSTs酶上调表达时,桔青霉菌中OTA的浓度增加。ABC转运蛋白(斑点9)是一种跨膜蛋白质,其广泛存在于各种生物体中,从细菌到人。其主要功能是利用ATP将底物与细胞结合。在pH5培养条件下上调的SAM(无菌Alpha基序)功能域(斑点12)是蛋白质模型之间相互作用的蛋白质,例如p63和p73的C末端的SAM功能结构域通过结合其他 蛋白效应物器来调节p63和p73的功能。

  

  4. 不同PH条件下OTA生物合成相关基因的相对表达

  

  通过测序,得到桔青霉菌转录组数据(表2),共9.91GB,用于后续的分析。  

  表2 测序统计结果  

  

  OTA合成能力的差异可能由基因表达差异引起;因此,必须研究在pH 3和5培养的桔青霉菌中差异表达的基因。通过对比,我们在两组样品中发现2200个差异表达基因(差异倍数≧2,FDR<0.05);其中,1024个基因表达上调,1176个下调。P3_vs_P5用于差异表达基因的分类,样本组P5较样本组P3中上调基因的表达更高,反之亦然。

  

  为了分析这些不同表达基因的功能,进行了GO和COG注释和分类(图4)。通过GO三个功能分类,进一步将4545个非冗余基因分为57个类别;许多unigenes同时被分配到不同的类别。然后,计算每个类别的DEG unigenes的百分比。这些结果表明,OTA在桔青霉菌中产量差异可能是由于这些类别中的几个不同表达的基因。

  

  不同pH值下培养的桔青霉菌转录组数据分析显示,由于一些代谢途径相关酶的低表达而导致酸性pH抑制毒素合成。此外,酸性环境下培养的桔青霉菌抑制了参与毒素生物合成调控的一些基因的表达水平;这也可以减少毒素的合成。DEGs GO分类最丰富的类别,包括氨基酸转运和代谢,碳水化合物的运输和代谢,无机离子转运和代谢,次生代谢产物的生物合成以及能量和供应代谢。这些不同表达的基因可能参与合成和OTA调节过程。

  

  图4 桔青霉菌中DEG的功能分类

  

  为了验证与OTA合成相关基因的表达差异,通过RT-qPCR分析了14个差异表达基因的转录水平,这些不同程度表达的基因与OTA合成相关(图5)。从pH 5条件下培养的桔青霉菌的结果可以看出,这些基因的表达水平明显高于在pH 3培养的菌株的表达水平。这些结果与转录组数据分析结果一致。

  

  图5 通过RT-qPCR验证不同表达的基因

  

  总之,结果表明,低pH条件抑制桔青霉菌中OTA的生物合成。蛋白质组学技术用于研究不同pH值培养条件下桔青霉菌中不同表达的蛋白质。结果表明,与pH 3条件相比,在pH 5培养基中有11种蛋白质表达上调,占蛋白质总数的44%。相比之下,大多数碱性代谢和合成相关蛋白以及与能量供应相关的蛋白质的表达水平都有所降低;这使得细胞很难维持生命活动。果糖二磷酸醛缩酶,丙酮磷酸酯酸水解酶,腺苷磷酸亚单位,谷胱甘肽S-转移酶活性在低pH(3)培养的桔青霉菌中均降低。果糖-二磷酸醛缩酶对器官系统提供ATP和底物,另外,谷胱甘肽S-转移酶可能与毒素转运相关。在低pH3条件下,果糖-二磷酸醛缩酶和谷胱甘肽的表达水平有限,而应激相关蛋白(如一些信号转导和脱氢相关蛋白)的表达增加。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的表达水平在低pH3条件下增加,这使得菌株免受压力。

  

  总结  

  通过对不同pH条件下培养的桔青霉菌转录组数据的分析,发现了OTA生物合成和代谢调控的机制。在pH3和5条件下,鉴定出19,598个差异基因。结果表明,一些基因在桔青霉菌的OTA合成中起重要作用。这些基因主要编码乙酰转移酶,聚酮合酶磷酸酯通用酰基半胱胺联合结构域,酰基辅酶A氧化酶,醇氧化酶,NAD(P)结合蛋白,乙酰木聚糖酯酶,细胞色素P450,ABC转运蛋白,β酮酶结构域蛋白质,转酮醇酶,醛醇酶和醇脱氢酶。此外,桔青霉菌的转录组数据不仅揭示了OTA合成和分子调控的可能机制,而且为控制OTA合成提供了科学指导。

  

  参考文献:  

  Integration of transcriptome and proteome datareveals ochratoxin A biosyn thesis regulated by pH in Penicillium citrinum. RSC Advances.2017.