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文献解读

集思慧远客户发表文章《与小麦抗白粉病基因 Pm48 紧密连锁分子标记的开发》

发布日期:2019-03-20 浏览次数:48

  摘 要:Pm48 为本实验室鉴定的一个抗白粉病新基因。为精细定位该基因,利用混池 ddRAD 测序鉴定了 81 个与该基因关联的序列,开发了 STS 标记 Xmp931,转化了 CAPS 标记 Xmp928、Xmp930 和 Xmp936;同时,利用粗山羊草基因组序列开发了 71 个基因组 SSR 标记, 定位了其中的 Xmp1089 和 Xmp1112。 在 115 个宁糯麦 1 号´Tabasco 衍生的 F2:3 家系中, Xmp928  

  与目的基因共分离,Xmp1112 位于近着丝粒方向处距抗病基因 3.1 cM。在 671 个纯合感病家系中,标记 Xmp928 仍与目的基因共分离。利用 3 个中国春 5DS 缺失系,最终将 Pm48 定位在小麦 5DS 上 0.63–0.67 的臂区段中。  

  关键词:小麦;抗白粉病基因;分子标记;混池 ddRAD 测序

  

  1 材料与方法

  

  1.1 试验材料

  利用抗小麦白粉病的德国品种 Tabasco 与本实验室培育的糯性感病品种糯麦 1 号,经杂交和自交获得 4129 个宁糯麦 1号×Tabasco F2 单株,用于抗性遗传分析;从 436 个 F2:3 家系[19]中随机选择 115 个家系组成分离群体用于新开发分子标记的多态性分析和定位。

  利用“中国春”及其缺失系 del5DS-1、 del5DS-2 和 del5DS-5 进行目标分子标记的染色体臂定位, 其中 del5DS-1 保留有 5DS末端 63%长度,缺失了 37%的染色体长度,del5DS-5 保留有染色体 5DS 末端 67%长度,缺失了 33%的染色体长度, del5DS-2保留有 5DS 末端 78%长度,缺失了 22%的染色体长度[21]。

  

  1.2 抗病性评价方法  

  参考高海东等[19]报道的方法评价白粉病抗性。将小麦种子播在 72 孔的穴盘,亲本品种及家系各播种 15~20 粒,每穴盘随机种植 9 粒感病对照苏麦 3 号。于幼苗一叶期人工接菌孢子,菌种为南京地区流行的 Bgt18。在人工智能气候室(14 h 光照/10 h 黑暗, 18~22℃, 相对湿度 80%~90%)中培养接种后的麦苗。接种后 7 d 天当感病对照表现出明显病症时调查病情,按盛宝钦[22]的 0~4 级分类方法记录,即 0 级为免疫,植株无病斑,0;级为坏死反应,叶片有枯死斑,1 级为高抗,病斑直径小于 l mm,菌丝层稀薄可见绿色叶面,偶见较大病斑,但仍透绿,产孢量极少,2 级为中抗,叶片病斑直径小于 l mm,但菌丝层较厚,不透绿,能产生一定量孢子,3 级为中感,叶片病斑多,且直径大于 l mm,菌丝层厚,产孢量大,但病斑不连片,4 级为高感,叶片病斑直径大于 l mm,菌丝层厚,产孢量多,病斑连片。

  

  1.3 分子标记开发

  

  1.3.1 基于 ddRAD 测序获得的序列  

  根据前期 F2:3 家系的分子鉴定结果[19],从中随机选取 50 个纯合抗病家系和 50 个纯合感病家系,每家系选取 8 株, 将其 DNA 等量混合构建抗池(BR)和感池(BS),由南京集思慧远生物科技有限公司进行 ddRAD测序。根据抗感池序列 SNP 是否产生酶切位点差异,决定转化成 CAPS 或 dCAPS 标记。如果抗、感池间的 SNP 存在酶切位点的差异,则直接将该 SNP 标记转化成 CAPS 标记,即在 SNP 位点两侧设计引物,并利用相应的限制性内切酶进行酶切;如果抗、 感池间的 SNP 不存在酶切位点的差异, 则利用软件 dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)和 Primer5.0 将 SNP 转化成 dCAPS 标记,即在引物中引入错配与 SNP 位点形成新的酶切位点。新开发的多态标记信息见表1。

  

  1.3.2 基于粗山羊草基因组序列

  高海东等[19]鉴定出 Pm48 的紧密连锁标记 Xmp510。本研究利用 Xmp510 序列及 ddRAD测序获得的多态标记序列,在线搜索比对粗山羊草标记序列(http://probes.pw.usda.gov/WheatDMarker/phpblast/blast.php)。先对相应的粗山羊草基因组序列进行 SSR 筛查,然后用 MACVECTOR V8.0(Accelrys, UK)设计引物,并进行亲本及抗感池间多态性筛选。新开发的多态标记信息见表 1。

  

  

  1.4 分子标记分析  

  参照 Ma 等[23]报道的 SDS 法,从小麦嫩叶中提取总 DNA,–4℃保存。在 SENSOQUEST LABCYCLER PCR 仪(德国)上扩增,反应体系为 10 µL,包括 1× buffer 10µL (含 MgCl2 15 nmol),DNA 模板 1 ng,左、右引物各 2 pmol,2 nmol 的 dNTPs,1 U Taq 酶。PCR 程序为 94℃预变性 5 min,然后按 94℃变性 30 s、50~60℃退火 45 s、72℃延伸 50 s 进行 36 个循环扩增,最后 72℃延伸 7 min。扩增产物经 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染法显色。  

  CAPS 标记选择特定的限制性内切酶(TaKaRa),如 Alu I、Acc I、Mae II、Hpy 188I 和 Taq I,按生产商说明书进行酶切反应,反应体系 8 µL,含 PCR 产物约 50 ng,于 37°C 或 65°C (依酶特性而定)过夜,用 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测酶切产物。

  

  1.5 遗传图谱构建

  

  采用 Mapmaker 3.0b/EXP[24]和 MapDrawV2.1[25]构建连锁图谱,选用 Kosambi 函数[26]计算遗传距离,连锁判断 LOD 阈值设为 3.0。

  

  2 结果与分析

  

  2.1 与 Pm48 连锁分子标记的开发及定位

  对抗池、感池进行 ddRAD 测序,获得 81 个可能与 Pm48 关联的 SNP 序列,将其中 14 个关联性强的 SNP 标记转化为STS 或者 CAPS 标记。其中,Xmp931 在抗、感亲本间有多态性,且与抗、感池表现一致;Xmp928 (图 1-A)、Xmp930 (图 1-B)和 Xmp936 经相应的限制性内切酶酶切后,在抗、感亲本以及池间表现一致多态性。利用这 4 个新开发的标记检测 115 个F2:3 家系,结果 4 个标记均被定位于 Pm48 的遗传图谱上,其中 Xmp928 与目标基因共分离,Xmp931、Xmp936 和 Xmp930位于远着丝粒的一侧,与目标基因分别相距 7.8、9.7 和 15.7 cM (图 2-A)。

  

  

  利用已定位 Pm48 连锁标记序列信息,比对粗山羊草基因组序列,开发了 71 个 gSSR 标记,其中 Xmp1089 (图 1-C)和Xmp1112 (图 3)在抗、感基因型间存在多态性,并且被整合到 Pm48 连锁图谱中,距 Pm48 分别为 3.1 cM 和 10.8 cM (图 2-A)。

  

  

  2.2 Pm48 的染色体臂定位

  利用 3 个中国春 5DS 缺失系对 Pm48 进行染色体臂定位,结果显示 Xmp1112 位于小麦 5DS 0.63~0.67 的染色体区段(图3),在该染色体区段中已定位标记 Xcfd81 [19],同时连锁图谱显示 Pm48 位于这两个标记之间(图 2-A),因此认为 Pm48 位于小麦 5DS 0.63~0.67 的染色体区段(图 2-B)。

  

  

  2.3 重组体的筛选  

  利用 4129 个 F2 单株,通过接种 Bgt18 鉴定抗病性,结果有 3103 个抗病单株和 1026 个感病单株,符合单个显性基因的3:1 分离(c2=0.04;c20.05,1=3.84)。这些感病单株移栽后完成整个生育期并收获种子的有 671 个家系,对每个家系衍生的 15~20个植株进行表型鉴定后, 推测均为纯合感病家系。 利用位于 Pm48 两侧的分子标记对这 671 个纯合感病家系进行基因型检测,其中共显性标记 Xmp1112 和 Xcfd81 分别筛选到 12 个和 8 个重组家系;标记 Xmp928 和 Xmp510 对这 19 个重组体进行基因型的分析结果表明,Xmp510 检测到 5 个重组体,Xmp928 没有检测到重组体,与目标基因共分离(表 2)。

  

  

  3 讨论

  

  为进一步精细定位小麦抗白粉病基因 Pm48,本研究利用简化测序和粗山羊草基因组序列信息开发了 6 个新标记。与实验室之前发表的遗传图谱[19]相比,本研究在 Xgwm205 与基因之间新增了两个 gSSR 标记(Xmp1089 和 Xmp1112),将 Pm48界定在 Xmp510 和 Xmp1112 之间的 4.6 cM 之间,为基因的进一步分离奠定了基础。此外,还开发了一个与基因共分离的标记 Xmp928,该标记无论在小群体中还是在扩大的纯合感病家系中均与抗病基因共分离,将作为抗病基因 Pm48 的重要选择标记。Xmp928 是重复序列连接(repeat junction)类型的标记,这类标记在重复序列超过 80%的小麦基因组中非常丰富[27],将是小麦基因定位的重要标记类型,然而该类型标记无法与基因序列关联,很难为基因分离提供帮助。

  

  简化测序可以降低测序成本,根据性状混池后测序更进一步降低成本。本研究利用 ddRAD 测序成功开发了 3 个 CAPS标记和 1 个 STS 标记,转化了与基因关联性强的 14 个 SNP 标记,其中 4 个(28.6%)为多态性标记,而其余标记没有多态性。对于没有转化成功的 10 个 SNP 标记,推测是由于 ddRAD 测序后获得的重复序列导致非特异性以及扩增引入的错配。本研究还利用粗山羊草基因组序列开发了 71 个 gSSR 标记,但只有 2 个被定位,多态率为 2.8%,远低于其他研究报道的 gSSR的多态率[28-30]。推测可能的原因,一是 D 基因组的多态性偏低[28-30],二是 Tabasco、宁糯麦 1 号两亲本的分子标记多态率低。对比上述两种方法,利用混池的 ddRAD 测序效率较高。

  

  本研究利用 5DS 缺失系成功将抗病基因 Pm48 定位在小麦 5DS 0.63–0.67 的染色体区段中,这一区段的物理距离大约为55 Mb [31]。标记 Xcfd81 和 Xmp1112 相距 8.0 cM,假定两标记位于边界,该区域的重组率估算为 0.145 cM/Mb,低于 Erayman等[32]在该区域估算的重组率(0.341 cM/Mb),并非重组热点区域。尽管如此,该区段较小的物理距离仍然将有助于抗病基因的分离。本实验室将在以下两方面进一步研究,一是解决标记多态性低的问题,准备利用不同的感病亲本与 Tabasco 构建多个分离群体,构建 Pm48 的饱和遗传图谱;二是利用混池进行转录组测序,发掘 Pm48 候选基因。