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文献解读

集思慧远客户发表《王枣子根、茎和叶的比较转录组分析揭示了王枣子素生物合成的候选基因》

发布日期:2019-03-08 浏览次数:79

集思慧远客户发表——《王枣子根、茎和叶的比较转录组分析揭示了王枣子素生物合成的候选基因》


Comparative transcriptome analysis of roots, stems and leaves Isodon amethystoides reveals candidate genes involved in Wangzaozins biosynthesis

杂志:BMC PLANT BIOLOGY

影响因子:IF=3.930



摘要: 王枣子是一种重要的中药植物,具有治疗多种疾病的药理作用,包括肺结核。四环二萜类化合物王枣子素(王枣子甲素Wang zaozin A,王枣子乙素GlucocalyxB)是王枣子的主要生物活性化合物。然而,关于这些化合物生物合成的分子信息仍然不清楚。通过对王枣子中王枣子素积累水平的研究,发现该植物的根、茎和叶组织有很大的变化,表明不同组织间代谢产物生物合成和积累的可能存在差异。为了更好地阐明四环二萜生物合成途径,我们对根、茎和叶组织进行转录组测序,并进行了de novo序列组装和分析。分析了与二萜类生物合成有关的候选基因,如CPS、KSL等。用qRT-PCR方法对8种涉及四环二萜类生物合成的转录本在王枣子不同组织中的表达谱进行了验证,解构该通路的基因表达谱。ISPD、ISPF和ISPH(MEP途径)以及IaCPS和IaKSL(二萜类途径)候选基因在叶片和根中的差异表达,可能是造成王枣子叶片中王枣子素积累较高的原因之一。本文报道的基因组数据和分析为进一步研究这一重要药用植物奠定了基础。



  材料与方法

  植物材料:一年生健康王枣子个体的根、茎、叶(3个重复)

  王枣子素的提取与鉴定(靶标代谢):

  种类:王枣子甲素、王枣子乙素和王枣子丙素

  仪器: Agilent Technologies 1260 Infinity Series HPLC

  转录组平台:Illumina HiSeq4000


  结果:

  四环二萜累积量

  为了研究四环二萜类化合物的分布规律,测定了王枣子植物三种组织(根、叶、茎)中三种主要的生物活性四环二萜类化合物王枣子甲素、王枣子乙素和王枣子丙素含量。



图1 不同组织中王枣子甲素、王枣子乙素和王枣子丙素的含量


  Illumina测序和组装

  为王枣子构建一个转录组数据库,从具有三个生物重复的根、茎和叶组织构建了9个RNAseq库。经过滤后,总共获得了65.28GB的数据,每个组织的为71M至74M。进行了de novo序列组装,获得230,974个转录本和114,488个unigenes,平均N50长度分别为1914和1241 bp。


  功能注释

  组装的基因被注释到KEGG的生物通路上,以更好地理解王枣子转录本在特定代谢途径中的作用(图2)。为了系统地分析细胞内的代谢途径和复杂的生物学行为,将注释到编码区的序列被map到KEGG通路数据库中。可将17,527份转录本(15.31%)分为五大类:“代谢”,“遗传信息处理”、“环境信息处理”、“细胞处理”和“生物系统”,有50个子类别和124个通路(图2)。这些酶在KEGG的23个次级代谢途径中有指定的功能(表1)。



图2 KEGG路径分类图。根据相应的生物学途径将基因分为五个分支


表1.王枣子的次生代谢途径


  差异基因表达分析


图3 转录本的差异表达分析

a各组织中差异表达的转录本数(P<0.05和FC>2)与其他两组织比较。b代表王枣子组织差异基因数目的Venn图



  参与四环二萜生物合成的基因

  用KEGG数据库对转录组数据进行鉴定,共鉴定出29个酶类的转录本。NCBI中 BLAST显示,这些候选转录本与各自匹配的同源性为67-99%。

  图5是四环二萜类王枣子素生物合成途径。用转录组数据分析了参与该途径的转录本表达情况(图5)。关于二萜途径中的一种重要酶-CPS,,在王枣子中发现5种转录本。对于ent-kaurene 合酶,我们检测出4个可能的转录本。并对这两种酶的候选基因进行了同源性分析(图6)。



图5 所提出的二萜类生物合成途径的原理图和已鉴定的基因的差异表达


图6 利用mega软件采用极大似然法对王枣子CPS和KSL候选基因进行系统发育分析




  赤霉素(GA)生物合成候选基因在不同组织中的表达模式

  王枣子素,属四环二萜类化合物,与赤霉素以及冬凌草素具有相同的骨架结构。据报道,冬凌草甲素与赤霉素具有相同的前体细胞。因此,En-Kaurene被认为是赤霉素和王枣素生物合成的常用底物。由于植物激素信号转导在根与叶、茎与叶之间表现出明显的富集作用,我们分析了三种组织中GA生物合成基因的表达。9种可能参与赤霉素生物合成的转录本被发现:三种赤霉素20-氧化酶(GA20ox),两种赤霉素3-氧化酶(GA3ox),两种ET-Kaurene氧化酶(KO)和两种ent-kaurenoic氧化酶(Kao)(图7a)。系统发育分析表明,这些与GA生物合成相关的候选基因与其他香茶菜属或双子叶中报道的基因有着密切的遗传关系(图7b)。这些候选转录本的差异表达可能导致不同组织间产生GA的差异。


图7赤霉素生物合成相关候选基因的表达

a.一种基于FPKM值的热图对赤霉素生物合成相关转录本的示意图表示;b利用mega软件用极大似然法对潜在基因进行系统发育分析。



  王枣子素生物合成候选基因的qRT-PCR验证

  为了验证转录组分析数据并评估不同组织之间的差异表达谱,我们选取了8个与王枣子素生物合成同源的转录本进行qRT-PCR分析.基于FPKM值的这些转录本的表达如图8所示。




图8不同组织间差异表达的8个基因的表达


总结

1、我们为王枣子构建了一个包含全面的转录组遗传信息库。这些数据使我们能够识别和表征与四环二萜代谢途径相关的TFs和候选转录本的分子功能,这为进一步了解王枣子素的生物合成提供了理论依据。

2、特别是鉴定了29个编码四环二萜类生物合成关键酶的转录本。叶片中IaISPD、IaISPE和IaISPF(MEP途径)以及IaCPS(如IaCPS 1)和IaKSL(如IaKSL 2和IaKSL 4)候选基因在叶片中的高表达可能是王枣子素在王枣子叶片高积累的原因之一。

3、对这些候选转录本进行集中的生化,酶,生理,和分子研究是有必要的,以更好地理解潜在的调控机制。有必要对这些候选转录本进行分子研究,以更好地理解潜在的调控机制。