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文献解读

集思慧远客户发表文章《全基因组鉴定铁皮石斛的WRKY家族基因和寻找WRKY潜在的靶基因》

发布日期:2019-03-17 浏览次数:173

  铁皮石斛  

  分类地位:单子叶植物纲,微子目,兰科,石斛属  

  

  摘要

  WRKY家族是最大的转录因子家族之一,在多种生物调节过程中发挥重要作用,包括生长、发育和胁迫响应。目前从铁皮石斛中鉴定出63个 Do-WRKY 基因。这些基因分为多个家族,第一个家族有14个成员,第二个家族有28个成员,第三个家族有10个成员,无法归类到以上家族的有11个成员。在WRKY基因上游1K的调节区域发现了ABA响应元件,S元素响应元件和低温响应元件。评估63个Do-WRKY 基因在寒冷胁迫下的表达模式和这些基因在根和茎中被低温调节的表达谱。为了进一步探索Do-WRKY基因在生物过程中的调节机制,需要研究WRKY的潜在靶基因。在这些基因中,大多数与胁迫相关基因的启动子中包含多个W-box元件。此外,参与多糖合成和水解的基因在它们上游1K的调节区域含有W-box元件,暗示Do-WRKY的靶基因可能在多糖类的新陈代谢中发挥重要作用。这些结果为研究兰科植物WRKY基因的功能和了解下游调控网络提供了一个基础理论。

  

  材料与方法

  1. 植物材料和胁迫处理  

  用1/2 MS固体培养基培育铁皮石斛幼苗,萌发后10个月的幼苗作为实验材料。对照组用1/2 MS液体在室温条件下培养,实验组在4℃条件下培养。分别在0h,2h,6h和12h去取根和茎,每个时间点取6棵植株作为一个样品,用液氮冷冻后置于-70℃保存。每个实验做3个生物重复。

  

  2、铁皮石斛的WRKY基因鉴定和系统发育分析  

  从(http://202.203.187.112/herbalplant/)下载铁皮石斛的CDS序列,用HMMER 3.0软件将所有潜在的Do-WRKY TFs从铁皮石斛蛋白序列数据库中筛选出来。用NCBI检测潜在的Do-WRKY TFs序列,剔除没有保守结构域和锌指结构域的序列,将剩下的序列用ClustalX version 2.1软件比对,系统进化树用无根相邻嵌入法建立。

  

  3、保守序列分布和基因结构分析  

  用(version 4.11.2,http://meme.nbcr.net/meme)分析每条Do-WRKY的氨基酸序列的保守序列。在基因结构分析中,DoWRKY基因的相关基因组序列来自从药用植物数据库中下载的铁皮石斛基因组序列(http://202.203.187.112/herbalplant/),用基因组和CDS序列构建基因结构简图,数据来自北京大学生物信息中心(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)

  

  4、Do-WRKY基因启动子上的顺式调节元件分析  

  Do-WRKY基因上游1kb的启动子调节序列从数据库下载获得,从植物顺式作用调节DNA元件数据库PLACE(https://dbarchive.biosciencedbc.jp/en/place/download.html)下载的顺式作用元件序列分析上游1kb启动子上的顺式作用元件是否存在。在基因物理图谱中标记和显示生物和非生物胁迫响应元件的位置。

  

  5、WRKT潜在靶基因的鉴定和注释  

  将DoWRKY的DNA上游1kb的序列从基因组序列中筛选出来,用于检测WRKY TF 结合位点元件(C/T)TGAC(C/T)是否存在。然后用实验的方法在植物中验证所有WRKY TF得结合位点。在上游启动子区域存在3个或更多失水响应元件时,TFs和失水响应元件之间的识别效率越高,这一现象已用酵母单杂实验证实。用NCBI,GO和KEGG的功能注释:WRKY的靶基因至少拥有3个潜在的WRKY结合位点。

  

  6、qRT-PCR  

  用RNA提取试剂盒Column Plant RNAout2.0 (Tiandz, Inc., Beijing, China)提取RNA,然后反转录成cDNA,用ABI 7500 RT system对63个候选基因进行qRT-PCR,每个反应设置3个生物重复。

  

  7、表达数据的聚类分析  

  根和茎的表达模式热图通过 R 3.4.0.作图,用Sigmaplot 12.3软件的Dunnett测试方法统计分析

  

  结果

  1、  Do-WRKY转录因子的鉴定  

  从HMMER3.0平台获得83个已知的WRKY基因,通过NCBI BLAST进一步分析确认其中有81个具有WRKY结构域。这81个WRKY基因被编号为DoWRKY 1到DoWRKY 81。将没有WRKY domain的DoWRKY 蛋白序列剔除,用3‘ RACE验证剩余的63个Do-WRKY。发现高度保守的七肽区域WRKYGQK 存在于56个DoWRKY 蛋白序列中,有52个含有锌指结构。

  

  

  2、  Do-WRKY蛋白质的分类  

  分析At-WRKY和Do-WRKY的系统发育关系,结果显示63个Do-WRKY蛋白可能被分类为3个家族:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ。家族Ⅰ包含14个DoWRKY蛋白质,其中10个含有2个保守的WRKY区域(WRKYGQK)和2个锌指motifs,另外4个只含有1个WRKY结构域。家族Ⅱ可以进一步分成5个亚家族,Ⅱa有4个成员,Ⅱb有3个成员,Ⅱc有9个成员,Ⅱd有6个成员,Ⅱe有6个成员,家族Ⅱ中的所有成员包含高度保守的WRKY结构域和锌指结构。家族Ⅲ包含10个成员,每个成员含有单一的WRKY结构域和一个修饰后的锌指结构。

  

  

  3、  Do-WRKY蛋白质的序列结构  

  一般来说,拥有相似motifs的成员,通常拥有相似的功能。为了更好的了解DoWRKY蛋白motif的相似性和多样性,用在线软件MEME分析DoWRKY蛋白的保守motif。(http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi). 发现一共有20个motif, motif 1和motif 6都含有一个七肽motif结构:WRKYGQK,这是WRKY 家族的一个基本特征。

  

  

  4、  Do-WRKY基因的外显子—内含子结构分析  

  通过分析内含子/外显子的分布,深入了解Do-WRKY基因的结构特征,可以作为分析进化信息的一部分。在这63个Do-WRKY基因中,31个有3个外显子和2个内含子,10个含有5个外显子和4个内含子,9个含有4个外显子和3个内含子,8个含有2个外显子。拥有相似内含子/外显子成分的DoWRKY基因通常会分类到同一家族。

  

  

  5、  Do-WRKY基因启动子上的胁迫相关调节元件  

  顺式作用元件,通常位于基因的5’端上游区域,是转录因子的结合位点,负责调节基因的转录。因此,在63个Do-WRKY基因上游1kb的调节区域内搜寻胁迫相关的调节元件。正如预料的那样,大多数Do-WRKY基因的上游存在多个ABA响应元件。ABA在植物中是响应多种不利环境条件的重要信号分子,包括:寒冷、盐害和干旱。Do-WRKY基因启动子上的低温响应元件数量仅次于ABA响应元件,能够驱动基因的表达来响应低温。硫响应调节元件能够调节硫在植物体内的分布,也大量存在于启动子上,暗示Do-WRKY基因在石斛属植物中调节硫的分布中发挥重要作用。

  

  

  6、  Do-WRKY基因在寒冷胁迫下的表达  

  根据Do-WRKY基因上游1kb调节区域含有数量众多的低温胁迫响应元件的现象,为了获得这些基因的表达模式,对铁皮石斛的幼苗进行寒冷胁迫处理。用qPCR检测根和茎中的DoWRKY基因在寒冷(4℃)的表达谱,用RNA-seq测定叶中此基因的表达谱。数据表明:根和茎中的Do-WRKY基因受低温的调节。至少有两个基因(DoWRKY1 和 DoWRKY14 )的表达出现上调。

  

  

  7、  Do-WRKY潜在靶基因的鉴定和注释  

  测序后一共获得了34417个潜在的铁皮石斛基因,其中10757个基因在它们的启动子上至少含有1个W-box元件,有7127个基因在启动子上至少含有2个W-box元件,有3515个基因的启动子上至少含有3个W-box元件。在这3515个基因中,Nr数据库显示有2504个基因与其他已知的基因和蛋白质有相互作用。根据序列同源性,用GO数据库注释了1305个基因,只有353个基因比对到了KEGG数据库中的参考代谢通路上。GO数据库将WRKY的靶基因在3个主要分类:生物过程,细胞成分和分子功能中分成了42个功能组。在生物途径分析中,一共有253个基因分配到88个KEGG通路中,包括4个主要种类:新城代谢,环境信息过程,遗传信息过程和细胞过程。大多数基因都归类到新城代谢组中。

  

  

  

  8、Do-WRKY潜在靶基因的胁迫代谢路径  

  Fig.8显示的是植物中与胁迫相关的代谢通路。一个ACC合成酶基因(ACS)和2个ACC氧化酶基因(ACO)参与乙烯的生物合成途径。GDP-D-甘露糖焦磷酸化酶(GMPase)基因和GDP-甘露糖 3,5-差向异构酶(GME),两者都参与L-抗坏血酸的生物合成,在它们的启动子上有3个W-box元件。海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因上游1 kb调节区域包含3个W-box元件。这些结果显示:Do-WRKY基因可能通过调节胁迫相关基因的表达在铁皮石斛中发挥重要作用。

  

  

  9、Do-WRKY靶基因可能是多糖代谢相关基因

  

  从以上分析可知:所有潜在的WRKY靶基因至少含有3个W-box元件。在糖类新陈代谢相关的基因中发现了这个现象。例如:糖基转移酶类:葡萄糖基转移酶,木糖基转移酶,半乳糖基转移酶,纤维素合成酶和甘露糖合成酶,都参与糖类的生物合成,在它们的上游1kb调节区域包含3~7个W-box元件。定位于高尔基体的核酸核糖转移酶通过给高尔基体提供蔗糖对糖类的生物合成是必要的。Do-WRKY基因也可能调节这类糖转移酶基因的转录,因为糖类转移酶基因的启动子上也有W-box元件。甘露糖苷酶和葡聚糖苷酶基因在上游1kb调节区域包含3~12个W-box元件,预示DoWRKY基因可能调节糖类的水解。研究还发现W-box元件也存在于淀粉酶的启动子上。

  

  

  结论  

  从一种兰科植物——铁皮石斛中鉴定出63个WRKY基因。分析了DoWRKY蛋白的分类和保守结构域,以及Do-WRKY基因启动子上的胁迫响应元件。63个DoWRKY基因中的17个受寒冷胁迫诱导,预示它们在铁皮石斛响应寒冷胁迫中发挥重要作用。本研究探索了WRKY的靶基因,其靶基因的启动子上含有W-box元件。研究发现在胁迫相关基因和碳水化合物代谢相关基因上有多个W-box元件,预示Do-WRKY基因可能参与调节非生物胁迫响应以及碳水化合物代谢。

  

  参考文献  

  A Genome-Wide Identification of the WRKY Family Genes and a Survey of Potential WRKY Target Genes in Dendrobium officinale[J] Scientific Reports. 2017.IF=4.259