集思慧远客户发表文章《亚洲梨在收获和储藏时表皮蜡质的化学成分、晶体形态和关键基因表达的研究》

  梨  

  学名: Pyrus spp  

  分类地位:被子植物亚门，双子叶纲，蔷薇目，蔷薇科，梨属  

  摘要

  对3种亚洲梨：库尔勒，雪花和玉露香在收获和贮藏7个月后表皮蜡质的化学成分，晶体结构和相关基因的表达水平进行分析、测定。其中，蜡质含量最高的是库尔勒，最低的是雪花。表皮蜡质的主要成分是烷烃，脂肪醇，萜烯类化合物，脂肪酸和醛类化合物。储藏后，所有品种的蜡质含量都出现减少，蜡质的晶体结构变得光滑。玉露香水果对黑斑病的抗性最强。基因表达分析显示：在贮藏后涉及蜡质合成的4个结构基因（CER6, KCS9, KCS20 and FDH1）的表达水平较高，另外3个（CER60, DGAT1 and MAH1）的表达水平较低，2个转录基因（LTPG1 and LTP4）和1个转录激活因子（MYB96）的表达水平与蜡质含量一致。总的来说，了解水果在收获和贮藏后表皮蜡质的差异能够更好地理解它们对抗病性的贡献和收获后的储藏性能。

  材料与方法

  1.  植物材料

  从用于商品的梨中挑选没有疾病感染、物理损伤的3种不同品种的梨作为实验材料。库尔勒（Pyrus sinkiangensis Yü）收获于2015.9.9，雪花（Pyrus bretschneideri Rehd.）收获于2015.9.4，玉露香（‘Kuerle’ × ‘Xuehua’）收获于2015.9.7.收获后每个品种取100 个立即用来测定相关数据，另外每个品种再取100 个贮藏在3℃（相对湿度60~~80%）7个月，然后取出，在室温下进行相关实验。

  2.表皮蜡质的提取  

  将果实洗干净后，于通风厨内把果实放在600mL氯仿内浸泡并搅拌1min,然后脱去其它物质，称量并记录蜡质的重量

  3.表皮蜡质含量的测定 

  提取5个梨的表皮蜡质，计算5个梨的表面积，蜡质含量（g/m2）的计算方法为（W1-W0）/Sa, W1=容器和蜡质的总重量，W0=容器的重量，Sa=5个梨的表面积。

  4. 通过气相色谱-质谱联用仪分析化合物  

  将1mg的蜡质溶解在1.2mL的氯仿中制成样品。用450-GC，连接320-MS和BR-5 ms毛细管色谱柱，（FS 30 m，0.25um ID，0.25 um df）.用氦气作为流动相，流动速率为1.2mL/min。参数设置如下：入口温度280℃，MS离子束280℃，离子源250℃，四级杆温度150℃，电子电压70eV,质荷比的范围：50~~650。  

  气相色谱以下列温度设置进行：首先，温度在50℃维持2min，接下来以每分钟上升40℃增加到200℃， 在200℃维持2min，最后，以3℃/min的速度增加到320℃，维持这个温度30分钟，每个单独蜡质的样品与标准品进行比较。

  5.电子显微镜观察  

  从每种梨的中部用刀片取一块（3 x 3 x 1 mm）的果皮切片，用2.5%的戊二醛固定1小时。然后用磷酸盐缓冲液（PBS，0.1mol/L, ph=7.4）冲洗3次，每次10分钟。接着切片用2%的锇酸（脂肪染料）处理1小时，用与上步相同的方式用PBS缓冲液冲洗。用不同浓度的乙醇30%，50%，70%，80%，90%进行脱水，依次处理10分钟，然后用100%乙醇进行两次脱水，每次10min。接着将样品放在乙醇/叔丁醇=1:1的溶液中浸泡10分钟。最后，产物放在叔丁醇中用Hitachi ES-2030 freezing drier冷冻干燥6小时。固定到样品架上制成能够观察的标本，用电子显微镜进行观察。

  6.通过qRT-PCR进行基因表达分析  

  总RNA的提取用Column Plant RNA Out kit (Fuji, China),cDNA的合成用RevertAid 1ST cDNA Synth Kit (Thermo, USA).用Primer Premier 5软件设计特异性引物。qRT-PCR反应使用Light Cycler 480 (Roche, USA)定量仪。

  7.无损伤接种  

  7.1悬浮孢子的制备  

  黑斑病（Alternaria alternata）的致病孢子由南农植保学院提供。其孢子是从培养7天菌丝的PDA培养基上分离出来，悬浮在无菌蒸馏水中，悬浮液用3层灭菌擦镜纸过滤，除去所有菌丝。为了让孢子均匀分散，可将悬浮液放在振荡器上震荡15s。用血球计数板和无菌蒸馏水将孢子悬浮液的浓度调整为1*106个/mL。  

  7.2侵染  

  将梨用水洗干净，风干，然后完全浸泡在孢子悬浮液中，使其表面形成一层菌膜。每个水果单独放置在自封袋中在25℃条件下保温7天。每个品种取60个随机分成3组，每组20个，从第7天到第22天，每3天统计一下发病率，发病率以百分比的形式表示。

  8.统计分析 

  表皮蜡质的化学成分用NIST 2013文库进行分析。为了检测聚类和建立关系，蜡质成分的数据集的主成分分析（PCA）和热图分析使用R 软件进行。偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）用SIMCA-P software (V11.0, Umetrics, Umea, Sweden)操作。

  结果  

  1.  三个品种梨的表皮蜡质在收获和贮藏时的化学成分的对比  

  1.1蜡质总量  

  三种梨在收获后的蜡质总量通过氯仿萃取获得。蜡质含量：库尔勒>玉露香>雪花。GC-MS结果显示:三种梨的蜡质成分在收获时很相似，主要包括：烷烃，脂肪醇，脂类，脂肪酸，萜烯类化合物，醛类和其它未归类的化合物。  

  库尔勒品种的蜡质主要是：烷烃，脂肪醇  

  雪花品种的蜡质主要是：脂肪醇，萜烯类化合物 

  玉露香品种的蜡质主要是: 脂肪醇，烷烃

  我们也分析了三种梨贮藏7个月后的蜡质含量，与收获时相比，贮藏水果的蜡质含量有明显的减少。为了进一步说明蜡质成分受贮藏的影响，我们对数据做了偏最小二乘判别分析（PLS-DA），结果显示：每种水果的蜡质在收获和贮藏后都有明显差异。

  1.2 超长链（VLC）脂肪族化合物

  所有品种梨蜡质的主要成分是超长链脂肪族化合物，包括烷烃（C16~C43,17.36%~~54.60%），脂肪醇（C17–C41, 11.49%–38.67%），脂肪酸(C16–C24,3.51%–11.97%)，醛类(C16–C18, 0–5.29%)，酮类，烯烃和酯类（2.43%–8.62%）。

  1.3萜烯类化合物的比较分析

  除了脂肪族化合物之外，用GC-MS分析在表皮蜡质中发现了18种萜烯类化合物。贮藏7个月后，库尔勒的萜烯类化合物明显增加，雪花的明显减少，玉露香的无明显变化。

  2.在收获和贮藏时的脂质结构  

  用扫描隧道电子显微镜（FESEM）鉴定三种梨在收获和贮藏时的蜡质结构。（FESEM）观测结果显示：三种梨的蜡质晶体结构各不相同，库尔勒品种的蜡质晶体最厚，雪花品种的最薄。玉露香品种的介于两者之间。

  3.表皮蜡质对黑斑病菌侵染的影响  

  水果的表面覆盖着蜡质能够阻挡孢子萌发和菌丝生长。我们发现用黑斑病菌侵染三种梨在收获和贮藏后的果实，表皮蜡质对病菌有抵抗功能。结果显示三种梨在侵染后从第7天到第22天，黑斑病的发病率逐渐增加

  4.涉及蜡质合成，转运和调节基因的表达模式  

  为了探究三种梨的表皮蜡质不同的分子基础，用qRT-PCR检测了17个涉及蜡质合成，转运和调节基因的表达水平。四个基因（KCS9,LTP3,CER2，MYB96）在贮藏后的表达水平比收获后的高，另外7个基因（KCS20, CER6, FDH1, LACS2, GL8, LTPG1，LTP4）在贮藏后的表达水平比收获后的低。

  结论  

  总的来说，烷烃和脂肪醇是三种梨表皮蜡质的主要成分。与收获时相比，贮藏7个月后，表皮蜡质含量减少。三种梨表皮蜡质的晶体形态不同，可能是因为蜡质成分的比例不同。此外，研究显示表皮蜡质对抵抗黑斑病具有贡献。KCS20, CER6, KCS9, LTPG1 and MYB96的表达水平显示这些基因在蜡质合成中发挥重要作用。

  文章点评  

  1.果实表皮蜡质是有机物，用丙酮将其溶解萃取、分离、纯化后研究，是一个很好、很精细的研究方法。  

  2.本文运用电子显微镜，以肉眼可见的微观角度观察表皮蜡质，有图有真相，很有说服力。 

  3.本文先研究生理生化的变化，然后研究引起变化的基因，用qRT-PCR结果做证据，由现象找原因是正向遗传学的经典方法。

  参考文献 

  Chemical composition, crystal morphology and key gene expression of cuticular waxes of Asian pears at harvest and after storage[J] Postharvest Biology and Technology. 2017. IF=3.248