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文献解读

集思慧远客户发表文章《核盘菌对油菜不同侵染阶段的转录组分析》

发布日期:2019-03-17 浏览次数:64

  核盘菌:

  分类地位:子囊菌亚门、盘菌纲、柔膜菌目、核盘菌科、核盘菌属。是一种危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌。核盘菌可以广泛地侵染很多单子叶和双子叶植物。另外,此菌危害十字花科、豆科、茄科、芸香科等植物。一般情况下见到的多为该种的菌核,子囊盘从菌核上产生,油菜菌核的子囊盘比较容易获得。

  

  

  摘要  

  油菜菌核病是一种造成许多重要作物巨大经济损失的重要的植物病原菌。核盘菌与其宿主的相互作用比最初想象的更复杂,至今难以理解。在本研究中,对核盘菌侵染油菜叶片的RNA进行转录组分析。我们比对到了11,074,508 and 11,495,788对双端reads。一共获得了13313个基因。并按照 他们的功能类别进行分类。用核盘菌侵染6小时(hpi)和24小时后,不同上调程度的差异表达基因(DEGs)主要集中在DNA结合基因和ATP结合基因。然而离子结合和氧化还原酶基因在24小时后被激活。大部分在48小时后上调的DEGs属于水解酶类。这些基因的表达水平与水解酶的功能相关。结果显示:不同的基因在不同的阶段被激活。在侵染过程中,我们对被激活的令人感兴趣的基因的相对表达水平通过qRT-PCR进行评估。我们的研究结果为核盘菌的侵染机制提供了新的理论。

  

  材料与方法

  1.植物材料,真菌和生长条件  

  野生型油菜品种NRS-1用土壤种植在花盆中,至于温室中,温度为20±2℃,相对湿度为60~~90%,光照为12小时,黑暗为12小时,培养20周,核盘菌在PDA培养基上于25℃培养5天。

  

  2.样品收集和制备  

  用于转录组测序RNA的样品在4个不同时间点提取:没有侵染的核盘菌,侵染油菜6小时后的核盘菌,侵染油菜24小时后的核盘菌,侵染油菜48小时后的核盘菌,用含有核盘菌菌丝体的PDA培养基接种叶片表面,然后将核盘菌从叶片和PDA培养基分离出来,每个处理包含10个样品,将10 个样品的核盘菌收集起来,混在一起,用于提取RNA。

  

  3.RNA提取和测序  

  用RNEasy Mini Kit (Qiagen, USA)提取总RNA。总RNA的含量、纯度和降解量用Nanodrop 2000(Thermo Scientific, USA)分光光度计测定,在测序前用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量。每个样品中取出3 μg RNA用于 RNA 测序样品的制备。测序文库用NEBNext UltraTM RNA  Library Prep Kit for Illumina(NEB, USA)制备。文库质量用Agilent Bioanalyzer 2100 system 测定。待测序列扩增建库后, 在Illumina Hiseq platform上进行125 bp/150 bp 双端测序。

  

  4.De novo 组装  

  fastq格式的原始数据首先通过in-house perl scripts进行加工。在这个步骤中,clean data (clean reads)通过去除包含接头,ploy-N,低质量的reads而得到。与此同时,评估clean data中的Q20, Q30和GC含量。所有后续分析都给予高质量的clean data。核盘菌的参考基因组和基因模型注释文件从基因组网站直接下载。用Bowtie v2.2.3建立参考基因组数据库,用TopHat v2.0.12比对双端clean reads与参考基因组。

  

  5.Unigenes 的功能注释  

  参照NR,Swiss-Prot,KEGG和COG数据库用BLASTX方法,进行功能注释。

  

  6.qRT-PCR分析  

  每个时间点的RNA,取出2 μg用Prime Script RT Reagent Kit (Takara, Japan)反转录成cDNA。用 CFX 9600 Real-Time PCR System (Bio-Rad, USA).进行qRT-PCR,每个基因做3个生物学重复。以基因Actin的表达水平为内参,计算各个基因的相对表达量。

  

  研究结果

  

  1.核盘菌在油菜叶片上造成的发病过程  

  核盘菌接种到油菜叶片上之后,用照片记录了0,6,24和48小时后的发病症状。在0和6小时后,核盘菌没有显示生长,在24小时后,叶片显示出感染症状,斑块开始生长,在48小时后,斑块的面积比24小时之后的大很多,并继续生长,油菜叶片表面覆盖有菌丝体。

  

  

  2.Illumina RNA-Seq测序和De Novo组装和注释

  将核盘菌在接种0,6,24和48 小时后的转录组进行测序,并将结果组装。一共组装出698830个contigs,平均长度67bp,最终的N50长度为49bp。核盘菌在侵染过程的差异表达基因通过接种6,24,48小时后与接种0小时后的基因表达谱比对获得。分别发现了654个,449个和505个差异表达基因。

  

  

  3.差异表达基因的功能注释  

  以侵染0小时为参照,对接种6,24和48小时后获得的差异表达基因(DEGs)进行GO功能注释。A:接种5小时后的DEGs 分类。B:接种24小时后的DEGs 分类。C:接种48小时后的DEGs分类。

  

  

  4.在不同阶段激活的不同基因有不同的功能  

  以接种0小时的基因表达量为参照,接种6,24和48小时后的差异表达基因,根据它们的分子功能,对所有上调和下调的差异表达基因进行分类。A:接种6小时后上调的DEGs个数。B:接种6小时后下调的DEGs个数。C:接种24小时后上调的DEGs个数。D:接种24小时后下调的DEGs个数。E:接种48小时后上调的DEGs个数。F:接种48小时后下调的DEGs个数。

  

  

  5.有关基因表达水平的qRT-PCR验证  

  挑选出来的差异表达基因的相对表达水平用qRT-PCR获得,以接种0小时的基因相对表达量为标准,其它时间的数值是该时间的相对表达量与0小时的比值。

  

  

  结论  

  我们的结果显示在侵染早期阶段(0~~6hpi),核盘菌的目的是自身的生长。6hpi,差异表达基因主要参与菌丝体的生长,抑制由宿主植物产生的抗真菌蛋白的活性,降解植物细胞壁。在中期阶段(6~~24hpi),核盘菌依靠细胞壁降解酶的功能开始侵染植物。然而,并不是所有有助于侵染的酶都在中期产生。角质层降解酶和果胶酯酶基因在后期阶段被诱导(24~~48hpi),显示不同的酶在不同的阶段扮演不同的角色。我们的结果对核盘菌的侵染过程提供了新的见解,对负责油菜侵染过程提供了新的可研究基因。

  

  文章点评  

  1.本文主要从真菌的角度出发,运用转录组测序分析了真菌在侵染过程中自身基因发生的变化,并对有关的差异表达基因进行qRT-PCR验证.  

  2.侵染植物并对植物造成病害的真菌菌丝体会深入植物叶片中,本文只收集叶片表面的菌丝体而没有收集叶片内部的菌丝体,这会导致差异表达基因的数量统计有失偏颇。  

  3.本文用于转录组测序的RNA是每个时间的10个样品混合在一起进行的,没有设置生物学重复,单个时间的测序结果没有对比,会导致置信度不高。

  

  参考文献  

  Transcriptome Analysis of Sclerotinia sclerotiorum at Different Infection Stages on Brassica napus . Curr Microbiol .2017.IF=1.322