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文献解读

集思慧远客户发表《RNA序列分析揭示穿心莲种子萌发过程中激素代谢和信号转导的关键作用》

发布日期:2019-03-17 浏览次数:312




  穿心莲是东南亚广泛应用的一种传统药用植物,其提取物通常用于治疗肝炎和糖尿病以及炎症,认知和精神疾病。一般来说,这种植物是由种子繁殖的,但是种子的萌发是高度可变的。不可靠的发芽使种植变得更困难、效率更低、生产力更低。了解控制发芽的因素将使种植者能够设计提高种植效率的方法。

  本研究采用高通量测序法(RNA-seq)分析了穿心莲种子萌发过程中三个时间点即播种后0、28和48h的转录组变化。转录组比较分析表明,大多数变化发生在萌发的早期阶段。GO和KEGG通路分析表明,差异表达基因主要涉及丁酸盐、半乳糖、甘油磷脂和碳代谢,以及植物激素信号转导。在萌发过程中,赤霉素、脱落酸、乙烯代谢和信号转导相关基因的表达水平发生显著变化。qRT-PCR分析证实了相关基因的转录表达水平,这意味着激素代谢和信号转导在穿心莲种子萌发中的重要作用。本研究首次全面概述了与穿心莲种子萌发相关的基因表达,为进一步研究种子萌发的分子调控机制提供了转录组数据。


  材料与方法

  材料

  广西省贵港市地区的成熟植物中获得了健康的穿心莲。选择成熟的(黄褐色)种子,使其大小一致。种子初始含水量为11.6%,千粒重为1.1080 g。

  种子发芽测定:在37°C条件下,用恒温培养箱将种子浸泡于蒸馏水中,打破休眠。用75%(v/v)乙醇洗涤45s左右,再用0.1%(w/v) HgCl2浸泡5min。然后,用蒸馏水洗三次后,将种子撒在培养皿中的滤纸上。每盘播种100粒种子,每组4粒。所有样品均在实验室的培养箱中以光/暗循环(12h/12h)条件下(27.5±1°C)进行培养。当胚根长到1mm时,就算萌发出完整的种子。取3组种子进行RNA提取:播种后0h,28h,48h,每组3个重复。


  方法

  测序平台:Illumina HiSeq 2500,PE125;组装:Trinity;contig组装:TGICL;功能注释:NR,Swiss-Prot,COG,Pfam,BLASTX;GO注释;KEGG富集;qRT‑PCR。


  结果分析

  1.种子萌发性状的评估

  Fig.1 穿心莲种子萌发的评估


  表型分析表明,胚根在0、28、48 HAS具有萌发过程。在此基础上,确定28 HAS为种子萌发的起始期,48 HAS为种子萌发的高峰期。


  2.文库构建、RNA-seq和转录本的功能注释

  Fig.2 RNA-seq产生的Unigenes的特征分析


  a. Unigenes长度分布;b. Unigenes的BLASTX配对的同源物种分布


  3.穿心莲种子萌发过程中转录组的变化

  根据RNA-seq数据和单基因功能注释,进一步分析了种子萌发过程中转录组的变化。


  Fig.3穿心莲不同萌发阶段转录本动态变化的分析


  a.比较28 HAS与0 HAS,48 HAS与28 HAS,48 HAS与0 HAS的DEG数;b.维恩图显示了不同萌发阶段上调和下调基因的重叠;c.种子萌发过程中所有DEG的GO分析

  为了深入了解DEGS在种子萌发过程中的作用,对3个发芽期各DEGS的KEGG途径进行了分析。


  Fig.4穿心莲种子萌发过程中所有DEGs的KEGG分析


  a.KEGG在种子萌发过程中的富集;b.植物激素信号转导途径的热图。框的颜色表示不同的表达模式,红色(I)代表28 HAS出现的最高表达水平,48 HAS出现的最低表达水平;黄色(II)为0HAS出现的最高表达水平;绿色(III)为48HAS最高表达水平,28HAS最低表达水平;紫色(IV)表示48HAS最高表达水平,0HAS最低表达水平;黑色(V)表示28 HAS出现的最高表达水平,0 HAS出现的最低表达水平。


  结果预测,大部分DEGS与丁酸(butanoate)、半乳糖(galactose)、甘油磷脂(glycerophospholipid)和碳代谢(carbon metabolisms)有关。大多数参与植物激素信号转导的DEGS在28 Has和48 Has高表达,而在0 Has时未表达。这意味着植物激素信号转导是一个级联过程。植物激素信号转导途径中的基因在萌发过程中受到越来越多的代谢活性的刺激。


  4. GA、ABA和乙烯代谢相关基因的转录谱及信号转导

  此前的研究表明,多种植物激素,包括GA、ABA、生长素和乙烯在控制种子萌发中起着至关重要的作用。


  Fig.5植物激素相关基因在种子萌发过程中的表达模式


  GA生物合成基因GA20ox1和GA3OX2的表达在28HAS和48HAS时均高于0HAS,而48HAS与28HAS相比表达下调。这表明GA的生物合成在种子萌发初期开始和发展迅速,然后在高峰阶段减缓。相反,GA分解代谢基因GA2OX1和GA2OX8在种子萌发的三个阶段逐渐下调。

  RNA-seq分析显示ABA受体基因PYL2和PYL6被激活,而关键转录因子ABI5在种子萌发过程中被抑制,说明ABA信号转导参与。有趣的是,ABA的关键生物合成基因NCED5的表达在28HAS上调,48HAS下调,而0HAS下调。一个ABA分解代谢基因CYP707A4在28 Has和48 Has表达上调。表明ABA分解代谢在种子萌发过程中的动态参与。


  结果显示,与0HAS相比,与乙烯信号转导相关的3个基因EIN2、EIN3和ERF118在28HAS和48HAS被激活,这表明乙烯在种子萌发中起着关键作用。与28HAS相比,EIN3和ERF118在48HAS表达减少,这表明种子萌发可能需要快速的乙烯信号转导。


  5. 用qRT-PCR分析验证RNA-Seq数据

  为验证RNA-seq数据,采用qRT-PCR分析检测了13个显著DEGS的表达水平。

  Fig.6 RNA-seq数据的验证


  选择的基因大多是参与植物激素的代谢或信号转导相关的,还选择了一些与种子萌发没有明显关系但在种子萌发过程中表现出显著差异的基因。如图所示,这些基因的表达模式与它们的转录表达模式基本一致。


  总结

  1.结果表明,GA、ABA和乙烯代谢和信号转导等在控制种子萌发过程中起着重要作用,可能决定穿心莲种子是否发芽以及何时发芽。

  2.GA和(或)乙烯处理与温水浸种软化相结合,可能是促进穿心莲种子萌发的有效途径。

  原文链接:https://doi.org/10.1007/s00344-018-9839-2