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文献解读

集思慧远客户发表《24-表油菜素内酯诱导香蕉果实耐冷性的蛋白质组学分析》

发布日期:2019-03-17 浏览次数:55



  香蕉由于其更年期特性,是世界范围内重要的水果之一,保质期短。低温贮藏被认为是延长收获作物贮藏寿命的有效策略。然而,当贮藏温度低于13℃时,香蕉果实易受冷害(CI)的影响。香蕉果实的CI症状包括延缓黄色发育、皮肤斑点和和果实软化失败,这导致严重的质量恶化和巨大的经济损失。


  先前研究发现一些缓解香蕉果实CI的策略,其中包括乙烯、一氧化氮、硫化氢、苹果酸和热处理证明是有效的。植物激素被认为参与调节植物的反应、防御和适应环境。最近的研究表明,一些植物激素,包括乙烯、水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、油菜甾醇(BRs)和赤霉素(GAs)与果实冷应激响应有关。在这些植物激素中,BRs是一种综合性的功能性类固醇激素,参与了许多生理过程,特别是在提高植物对非生物和生物胁迫的耐受性方面。在收获作物中,施用外源BRs可显著提高芒果、青椒、油菜、番茄和葡萄藤对低温胁迫的耐受性。然而,BRs对香蕉果实CI的影响及其可能的作用机制还未见报道。


  材料与方法

  植物材料与处理

  植物材料:开花后约110天绿色成熟香蕉;

  处理组:40μM EBR水溶液中浸泡;

  对照组:水中浸泡;

  低温处理:置于8℃和85~90%RH条件下贮藏12天;

  生理学参数测定:CI指数、叶绿素荧光参数、相对电解质渗漏量、丙二醛(MDA)含量、总可溶性固形物(TSS)、总可溶性固形物(TSS)和可滴定酸度(TA)比值;

  蛋白质组学分析:果皮组织(中部),设置6个重复。

  注:设置3个重复对CI指数进行测定,每重复30个果实,并设置6个重复测定其它生理参数。


  蛋白质组学分析

  检测平台:2-D凝胶电泳、MALDI-TOF/TOF MS、LC-ESI-MS/MS;

  分析软件:MagicScan V6.0和PDQuestTM Basic 2-D凝胶分析软件8.0.1(Bio-Rad)用于电泳;Mascot 2.3.02软件用于搜库;Blast2Go软件(4.0版)用于GO富集;Cytoscapage(版本3.0.2)软件用于蛋白质互作分析;SIMCA(版本15.0)用于PCA分析、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和偏最小二乘(PLS)回归分析。


  主要结果

  香蕉果实经EBR预处理后冷藏生理特性的研究

  图1A描述了香蕉果实冷藏结束后(12d)的CI症状,果皮褐变、变色、皱纹严重。EBR处理能有效降低低温贮藏期间果实CI的严重程度(图1A和B)。随着CI的增加,对照果实中的Fv/Fm随着CI的发展而明显降低(图1C)。与对照相比,EBR预处理延缓了Fv/Fm的下降(图1C)。果皮的相对电解质渗漏量和MDA含量随贮藏时间的延长而增加(图1D和E)。在整个贮藏过程中,EBR处理果实的相对电解质渗漏量和MDA含量均显著低于对照果实(图1D和E)。此外,比对照果实相比,EBR处理还导致较高的TSS含量和TSS/TA(图1F和G)。


  Fig.1. Effect of EBR pretreatment on banana fruit after 12-day.

  图1.EBR预处理对香蕉果实12天后的影响

  注:在低温储藏下的香蕉果实(A)、CI指数(B)、Fv/Fm(C)、相对电解质渗漏(D)、MDA含量(E)、可溶性总固形物(F)和可溶性固形物/可滴定酸比(G)。数据为均值±标准差(n=3)。不同字母表示有显著性差异(p<0.05)。


  香蕉皮冷藏过程蛋白质组学分析

  采用双向电泳(2-DE)分析方法,研究了香蕉果实低温贮藏过程中蛋白质组学的变化。如图2所示,PDQuest2-D分析软件检测了700多个可重复的蛋白质斑点。经全密度归一化后,有55个斑点差异累积(P<0.05),丰度相差3倍以上,并通过MALDI-TOF/TOF MS和LC-ESI-MS/MS成功鉴定。

  Fig.2. two-dimensional electrophoresis maps

  图2 二维电泳图谱

  注:在低温贮藏的不同阶段,具有和不具有EBR处理的香蕉果皮的代表性的二维电泳图谱。标记的蛋白质点是被鉴定出来的显著差异的蛋白质点。


  已鉴定蛋白质的功能分类和积累模式

  根据BLAST2GO分析,将55个差异积累的蛋白质分为7个功能类(补充图S2、表1)。主要功能类为能量、新陈代谢、应激反应和防御以及蛋白质代谢过程。

  Table 1. Identity of proteins differentially accumulated from banana peel with and without EBR treatment at different stages of low temperature storage.


  表1.香蕉皮不同低温贮藏期EBR处理前后差异积累蛋白质的鉴定(部分)

  注:黑色是对照香蕉果实,而灰色则是EBR处理的果实。PC:肽段数目。进行非参数方差分析(Kruskal-Wallis检验),并对鉴定的蛋白质进行多重比较平均排序。不同字母表示具有显著性差异(p<0.05)。


  蛋白质差异积累的PLS-DA和PLS分析

  为比较EBR处理与不加EBR处理香蕉果实蛋白质的差异,采用PLS-DA分析方法。置换校验表明,原模型是有效的(补充图S4)。将PLS-DA模型的前两个潜在组分获得的分数和相关载荷组合在双曲线中。PLS-DA的前两个组分占样本间方差的59.8%(图3A)。如图3A所示,在第8天,沿着成分1从不同处理中分离出果实。在第12天,用不同处理的果实,沿着组分2分离出果实。相反,在第4天不同处理的果实在同一1/4内均有分布。与PCA分析相一致,这些结果也表明,在第4天的样本不能被区分,而来自不同处理的样本在第8天和第12天很容易被识别。此外,VIP值超过1.0的变量通常被认为在PLS-DA判别过程中起着重要作用。结果表明,VIP超过1的22种蛋白质(B10、B51、B29、B49、B53等)可以解释EBR处理后低温贮藏香蕉果实的分离(图3B)。


  Fig. 3. PLS-DA analysis of differentially accumulated proteins.

  图3.蛋白质差异积累的蛋白质分析

  注:(A)PLS-DA得分图;(B)按VIP评分排列的蛋白质,以解释PLS-DA分析中的差异。


  同时,采用偏最小二乘法(PLS)回归分析差异积累蛋白与生理特性的关系(图4)。置换校验也证实了原模型的有效性(补充图5)。结果表明,B53与CI呈极显著正相关(图4A),其次为B54和B10。B5与CI呈极显著负相关,其次为B39、B40、B33、B27和B37。所有这些蛋白质的VIP分数显著高于1,这表明这些差异积累的蛋白质主要贡献于CI(图4B)。同样,我们也发现了B10,B39、B33、B37、B40和B53与Fv/Fm值相关(图4C和D)。B10、B39、B21、B37、B53、B51与MDA含量显著相关(图4E和F)。其中B39、B10、B33、B37、B40、B53和B5与相对电解质渗漏有关(用高回归系数和VIP得分)(图4G和H)。


  Fig.4. PLS analysis on differentially accumulated proteins and physiological factors.

  图4.差异积累的蛋白质与生理因素的相关性

  注:CI(A)、FV/FM(C)、MDA(E)和相对电解质渗漏(REL)的回归系数(G);(B、D、F和H)根据VIP评分,鉴定出的蛋白质依次为CI、FV/FM、MDA和相对电解质渗漏。


  蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)关键差异累积蛋白的网络分析

  如上所述,CI涉及一个复杂的生物学过程,与众多蛋白质的相互作用有关。使用STRING数据库进行PPI分析可以帮助加强我们的蛋白质组学分析,获得更多的差异累积蛋白质的功能信息。因此,我们进行了PPI分析,进一步阐明EBR处理后差异积累蛋白的作用。在本研究中,PPI结果显示了四个重要的功能类别,共有23个节点(补充表S1),主要涉及能量代谢、蛋白质代谢、应激反应/防御和调节(图5)。EBR预处理影响蛋白质修饰,进而调节能量代谢和应激反应。此外,生物调控还可能促进香蕉果实在冷藏过程中的防御能力。总体上,PPI分析表明,参与不同生理过程的差异积累蛋白可能相互作用并协同作用以提高香蕉果实的耐冷性。

  Fig. 5. PPI analysis of differentially accumulated proteins.

  图5.差异累积蛋白的PPI分析


  总结

  外源EBR处理显著降低了香蕉果实冷藏过程中CI的发育和严重程度。低温下EBR预处理后香蕉果实蛋白质的差异积累主要与胁迫、能量代谢和分解过程有关。结果表明EBR处理能促进生长素信号传递、胁迫防御能力和抗氧化系统的增强。同时,EBR处理可抑制蛋白质降解,维持蛋白质生物合成,有利于香蕉果实在低温储藏过程中蛋白质功能的正常行使。蛋氨酸do novo合成相关蛋白被上调,可能有助于多胺的生物合成和增强耐冷性。EBR处理也保持了较高的能量状态,为蛋白质的生物合成和复性提供了足够的ATP。


  点击原文链接:https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1874391918302239查看论文全文